بقع الدم المجفف-إعداد وتجهيز لاستخدامها في تحديدكم والتقنيات الجزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير بروتوكول موحد لإعداد ومعالجة بقع الدم المجففة لاستخدامها لاحقا في المقايسات المناعية والتقنيات الجزيئية. يتم تحقيق ذلك عن طريق أخذ الدم الشعري أولا ونقله إلى بطاقة تصفية. الخطوة الثانية هي تجفيف بقع الدم بين عشية وضحاها والحصول على ستة ملليمترات من دوائر بطاقة المرشح.

بعد ذلك ، يتم تحقيق إيان الدم الجاف من اللكمات عن طريق الغمر في المخزن المؤقت على شاكر لمدة أربع ساعات على الأقل. ثم يتم تحرير EITs الانحلالية من الحطام عن طريق الطرد المركزي. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحليل EITs التي تم تطهيرها بحثا عن العلامات المصلية والجزيئية للعدوى بالتهاب الكبد B والتهاب الكبد C وفيروسات نقص المناعة البشرية عن طريق المقايسات المناعية والتقنيات الجزيئية المتاحة تجاريا.

نشأت فكرة استخدام المؤامرة التي تم جمعها على بطاقة تصفية مصنوعة من الخلوية منذ قرن من الزمان. ومع ذلك ، فإن الأشخاص الذين يستخدمون هذه الطريقة لأول مرة غالبا ما يكافحون حتى اليوم لأن مرحلة ما قبل التحليل بأكملها ، والتي تشمل تحضير ومعالجة بقع الدم المجففة لتحليلها النهائي ، لم يتم توحيدها لجميع تطبيقات اختبار بقع الدم المجففة تقريبا. بالنظر إلى هذه الخلفية ، نقترح بروتوكولا موحدا شاملا خطوة بخطوة لإعداد ومعالجة بقع الدم المجففة لاستخدامها لاحقا في الفحص المناعي والتقنيات الجزيئية.

يبدو أن العرض المرئي لهذه المنهجية أمر بالغ الأهمية كعدة خطوات مثل خلع الدم الشعري. هذا صحيح. ليس من السهل تعلم النقل إلى بطاقات التصفية أو إعداد اللكمات المناسبة من الحشود ، وبالتالي ، فإن الأفراد الذين يستخدمون هذه التقنية لأول مرة سيستفيدون بلا شك من التمثيل المرئي.

سيتم أخذ الدم الشعري من إصبع نيكو بواسطة فني من مختبرنا يوضح إجراء المعالجة. ستكون بقع الدم التي تم الحصول عليها بواسطة الفني كو ، الذي يعمل بالفعل لسنوات عديدة في مختبرنا للتشخيص البيولوجي الجزيئي لثقب الجلد. ارتد أولا زوجا من قفازات مطاطية اللاتكس التي تستخدم لمرة واحدة.

قبل ثقب الجلد ، يجب على المريض تدفئة يديه. يتم تدليك الإصبع بشكل كبير لإثراء تدفق الدم نحو موقع البزل العلوي. ثم قم بتنظيف جلد جانب بالمر من طرف الكتائب البعيدة للإصبع الثالث أو الرابع من اليد غير المكتوبة باستخدام ثقب مطهر مناسب للجلد بواسطة إبرة أمان تستخدم مرة واحدة.

يجب وضع الأصابع في وضع يسهل فيه الجاذبية جمع الدم على أطراف الأصابع. امسح أول قطرة دم بقطعة شاش لأنها قد تحتوي على سوائل زائد من الأنسجة. بعد تدليك الإصبع مرة أخرى لزيادة تدفق الدم في موقع البزل ، انقل القطرة التالية إلى إحدى دوائر بطاقة الفلتر دون لمس السطح مباشرة بطرف الإصبع.

دع القطرة الكبيرة التالية من الدم الشعري تتشكل على طرف الإصبع واجمعها في الدائرة التالية. استمر في هذا الإجراء حتى تمتلئ جميع الدوائر اللازمة أو يتوقف تدفق الدم أثناء التجميع. اسمح بنقع الدم في نسيج المرشح بواسطة قوى الشعيرات الدموية فقط.

لا تضغط أو تحلب الإصبع بشكل مفرط إذا كان تدفق الدم غير كاف لملء جميع الدوائر المطلوبة لبطاقة الفلتر. إذا توقف تدفق الدم ، ضع ضمادة على طرف الإصبع ، وقم بإجراء ثقب جلدي ثان على إصبع آخر إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الدم للفحص لتجفيف بقع الدم ، ضع بطاقات الفلتر على منشفة ورقية نظيفة في خزانة أمان بيولوجية واتركها تجف ، ويفضل أن يكون ذلك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في حالة عدم وجود أي مصدر خارجي للحرارة ، عند اكتمال عملية التجفيف ، يكون لبقع الدم لون بني غامق موحد ولم تعد هناك مناطق حمراء مرئية للتخزين.

ضع بطاقة ورق الترشيح في كيس واحد غير منفذ للغاز يحتوي على كيس أو كيسين مجففين لحماية العينات من الرطوبة. انقل هذا الكيس إلى الفريزر بدرجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر أو أقل في أسرع وقت ممكن. إذا لم تكن المجمدات متوفرة في ظل الظروف الميدانية ، فإن التخزين عند أربع درجات مئوية تحت الصفر أو حتى في درجة الحرارة المحيطة ممكن لمدة تصل إلى 14 يوما.

قم بإخراج بقعة واحدة باستخدام جهاز واحد بستة ملليمترات من كل دائرة مبللة بالدم من نقل بطاقة المرشح من الدرجة 9 0 3 ، وجميع بقع الدم المجففة المثقوبة من مريض واحد إلى بئر واحد من 12. تملأ لوحة البئر بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.05٪ توين 20 و 0.08٪ أزيد الصوديوم. كرر هذه الخطوات للحصول على سلسلة ثانية من EITs لبقع الدم المجففة من أجل إجراء التحليلات الجزيئية.

ثم ضع لوحة زراعة الخلايا على شاكر المختبر واترك بقع الدم الجافة تتخلص برفق لمدة لا تقل عن أربع ساعات أو يفضل بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تكون البقع خالية تقريبا من الدم وتشكلت المواد الطافية الانحلالية. انقل هذه EITs إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، ثم أخضعها للطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 10 ، 500 مرة G لحرية.

المواد الطافية من أي حطام تشكلت أثناء EITs Ellucian بالطرد المركزي جاهزة الآن للاستخدام في التحليلات المقصودة. يتم نقل السلسلة الأولى من EITs إلى أكواب للاختبار المصلي. يتم نقل السلسلة الثانية إلى أنابيب دقيقة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تحقق من EITs بحثا عن علامات فيروس التهاب الكبد B وفيروس التهاب الكبد C وعدوى فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام المقايسات المتاحة تجاريا واتبع تعليمات الشركة المصنعة المعنية بعناية. أخيرا ، يتم عرض نتائج الاختبار المصلي على المحلل الآلي بالكامل على شاشة النظام. تم تقييم فعالية البروتوكول المقترح لإعداد ومعالجة بقع الدم المجففة أولا من خلال تحليل 1،762 زوجا من بقع الدم المجففة في المصل فيما يتعلق بتحديد المستضد السطحي لفيروس التهاب الكبد B.

تم تعديل بروتوكول الفحص لأنه مع قيمة قطع تبلغ 0.05 وحدة دولية لكل مليلتر ، كانت 56.2٪ من EITs تفاعلية مقارنة بالنتائج التي تم الحصول عليها من سارة. يتوافق هذا مع معدل إيجابي كاذب قدره 14.7٪ في اختبار المستضد السطحي لفيروس التهاب الكبد B. وأشار تحليل خصائص تشغيل المستقبل للمعطيات إلى أن زيادة العتبة إلى 0.15 وحدة دولية لكل مليلتر من شأنها أن تؤدي إلى فصل مثالي للإيجابيات السطحية لفيروس التهاب الكبد B عن سلبيات المستضد السطحي لفيروس التهاب الكبد B عند التحقيق في أزواج بقع الدم المجففة في المصل من حيث وجود مستضد سطحي لفيروس التهاب الكبد B، تم الحصول على اثنين فقط من المتناقضين.

نشأت سارة السلبية الكاذبة من مرضى يخضعون للعلاج المضاد للفيروسات. أسفر التحديد النوعي ل H-B-V-D-N-A عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي من EITs الدم الكامل عن حساسية بنسبة 93٪ وبالتالي لم يتم الكشف عن سبع عينات ذات تركيزات منخفضة من H-B-V-D-N-A. تم تحديد أربع نتائج سلبية كاذبة فقط لمكافحة التهاب الكبد C من EITs لبقع الدم الجافة.

من المحتمل جدا أن تكون C المعنية مأخوذة من المرضى الذين تم حل العدوى لديهم منذ فترة طويلة. أشارت الحساسية التحليلية بنسبة 100٪ لتحديدات H-C-V-R-N-A من EITs لبقع الدم المجففة إلى الحساسية الممتازة لنهج التضخيم بوساطة النسخ متساوي الحرارة ، والذي تم استخدامه لتضخيم H-C-V-R-N-A. أدى اكتشاف الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية في EITs لبقع الدم الجافة باستخدام نظام مؤتمت بالكامل أيضا إلى حساسية تحليلية بنسبة 100٪ يوضح هذا الفيديو أنه من الممكن في الوقت الحاضر الكشف بشكل موثوق عن العلامات المصلية والجزيئية لالتهاب الكبد B والتهاب الكبد C وعدوى فيروس نقص المناعة البشرية في جميع البقع الدموية الضيقة ، حتى عند استخدام حجم شطف مرتفع نسبيا وتعديلات بروتوكولات المقالة التي تم وضعها لفحوصات المصل أو البلازما هي لم يتغير بشكل كبير.

ومع ذلك ، أكدت النتائج التي تم الإبلاغ عنها أيضا الحدود المتأصلة في تقنية بقع الدم الجافة. في بعض الحالات. كما تم اختبار البروتوكول المحدد في ظل ظروف ميدانية على 534 متعاطيا نشطا للمخدرات في مدينتي برلين وإيسن الألمانيين خلال المرحلة التجريبية من دراسة الأدوية والأمراض المعدية المزمنة.

أدت النتائج التي تم الحصول عليها إلى تعديل طفيف لخوارزمية الاختبار للمرحلة الرئيسية من دراسة الأدوية في ست مدن ألمانية كبيرة إضافية.