Electrospun ألياف نانوية السقالات مع التدريجات ​​في منظمة الألياف

هنا، نقدم بروتوكول لافتعال السقالات electrospun ألياف نانوية مع منظمة على مراحل من الألياف واستكشاف تطبيقاتها في تنظيم التشكل خلية / التوجه. التدرجات فيما يتعلق الخواص الفيزيائية والكيميائية للالسقالات ألياف نانوية تقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال الطب الحيوي.

تسمح تقنية التصنيع هذه بإنتاج سقالات من الألياف النانوية ذات التدرج في تنظيم الألياف. تقدم المنظمة المتخرجة فائدة متزايدة للسقالات المصنوعة من الألياف النانوية في المجال الطبي الحيوي. يوفر الغزل الكهربائي القدرة على إنتاج سقالات ألياف نانوية ذات مساحات سطحية كبيرة.

يتم التصنيع عن طريق الجمع بين البوليمر والمذيب المتطاير ، ثم تحريك هذا المحلول بمعدل ثابت من خلال حقنة ذات جهد عال مطبق يشحن المحلول ويطيل البوليمر أثناء إطلاقه من طرف الإبرة. والنتيجة هي ألياف بوليمر نانوية جافة يمكن جمعها بعدة طرق لتطبيقات مختلفة. في هذا البروتوكول ، قمنا بتدوير بوليمر بولي كابرولاكتون على مجمع الفجوة لتشكيل ركيزة ألياف محاذاة للحلفاء.

ثم استخدمنا قناعا يتحرك تدريجيا لتغطية هذه الركيزة بينما تم ترسيب ألياف PCL العشوائية. مرحبا ، اسمي كارل كالالا. من مختبر الدكتور شينغ.

نحن في قسم العلوم الصيدلانية وبرنامج الطب التجديدي الهولندي في المركز الطبي بجامعة نبراسكا. اليوم سنكون ، سنعرض بروتوكول تصنيع سقالة من الألياف النانوية بتدرج تنظيمي. بالإضافة إلى ذلك ، سنعرض التطبيقات الطبية الحيوية لهذه السقالات من خلال تغليف النانو وبذر الخلايا الجذعية.

أولا ، تأكد من ارتداء معدات السلامة المناسبة عند التعامل مع المواد الكيميائية التي يحتمل أن تكون خطرة. أ ، تتمثل الخطوة الأساسية في هذا الإجراء في تحضير محلول بولي كابرولاكتون أو PCL بتركيز تقريبي يبلغ 100 ملليغرام لكل مليلتر. قم بإذابة بولي كابرولاكتون في خليط من ثنائي كلورو الميثان وثنائي ميثيل للأميد بنسبة أربعة إلى حجم واحد على الحجم لكل مذيب معين بتركيز إجمالي قدره 10٪ من الوزن من حيث الحجم لمزيج المحلول حتى يصبح المحلول شفافا ومتجانسا مع لزوجة مناسبة.

أضف محلول PCL إلى حقنة سعة خمسة ملليلتر بإبرة حادة قياس 21. المرفق ضع مضخة حقنة واحدة في وضع الغزل الكهربائي العمودي مع المجمع أسفل أرض مضخة الحقنة مباشرة. يضمن المجمع أن المجمع مطحون بشكل فردي دون اتصال بمعدات المختبر الأخرى.

لترسب الألياف بكفاءة ، اضبط مضخة الحقنة على معدل تدفق مرتفع نسبيا لتجهيز الإبرة للغزل الكهربائي. قم بتشغيل المضخة حتى يتم استبدال القطرات المتكونة عند طرف الإبرة على الفور. عند إزالتها ، للغزل الكهربائي ، اضبط المضخة على 0.5 مل في الساعة.

أدر مشغل الجهد إلى 12 كيلو فولت. الحذر لأن هذا الجهد العالي يمكن أن يكون خطيرا جدا لتجنب أي قرب. باستخدام طرف الإبرة ، نستخدم امتدادا غير موصل للتعامل مع أي انسدادات محتملة أو ألياف غريبة قد تحدث على طرف الإبرة أو عند المجمع.

يجب أن تبدأ الألياف في الظهور عبر الفجوة الموجودة على المجمع. استمر في الغزل الكهربائي حتى يتم تصنيع حصيرة ألياف سميكة نسبيا. عبر الفجوة الموجودة على المجمع ، ضع الغراء على حواف لوح زجاجي صغير.

يجب أن تكون أبعاد اللوحة أصغر قليلا من مجمع الفجوة مع الألياف المحاذاة ، بحيث تتم إزالة السقالة بشكل فعال. قم بإزالة أي ألياف غريبة قد تكون تراكمت في مقدمة المجمع. ثم ضع المجمع على الزجاج حتى تتلامس حصيرة الألياف بشكل كامل مع اللوحة.

وسادة ، السقالة برفق لضمان اتصال الألياف مباشرة بالغراء. دع السقالة تجلس حتى يجف الغراء. بمجرد تجفيف الغراء ، قم بقص الحواف الملصقة للسقالة بعناية ، بحيث يظل جزء من الحصيرة المحاذاة ثابتا على اللوح الزجاجي.

يجب أن تبدو النتيجة مثل هذه مع تثبيت السقالة الليفية من ثلاثة جوانب للترسيب الثانوي. إذا كان التغليف الكيميائي مطلوبا ، أضف كومار وستة. أضف تركيزا بنسبة 1٪ من الوزن بالوزن إلى محلول PCL امزج حتى يصبح المحلول متجانسا ويظهر لونا أخضر فلوريا لتحضير التدرج.

ضع مضخة الحقنة الثانية بشكل عمودي على المضخة الأولى والمجمع. قم بتوصيل قناع بلاستيكي بمضخة الحقنة الثانية وضعه فوق المجمع. قم بإعداد الإبرة باستخدام معدل تدفق مرتفع.

عندما تبدأ الألياف في الترسيب فوق المجمع ، اضبط مضخة الحقنة الأفقية على السحب بسرعة تسعة ملليلتر في الساعة أو سرعة تقريبية تبلغ ملليمتر واحد في الدقيقة. مع تقدم التجربة ، يجب أن يكون المزيد من الألياف العشوائية مرئية على السقالة المحاذاة. تعمل الأصباغ مثل Kumar و Six على تحسين تمثيل التدرج البصري بشكل كبير.

مع تقدم ترسب الألياف ، ستبدأ ألياف نانا في الترسيب خارج النطاق المطلوب للمجمع. قم بإزالة هذه الألياف باستخدام قضيب غير موصل حتى لا تتداخل مع سقالة الألياف ، تدور الألكترود حتى يتحرك القناع بالكامل تقريبا عن المجمع. تأكد من ترك كمية صغيرة من سقالة الألياف المحاذاة تحت القناع.

يجب أن تحتوي السقالة النهائية على أجزاء مكونة محاذاة وعشوائية مميزة متصورة هنا مع الترسيب العشوائي الأخضر والألياف المحاذاة البيضاء ، يجب أن يكون التغيير التدريجي من محاذاة الألياف العشوائية إلى محاذاة الألياف أحادية المحور واضحا في المنطقة المتوسطة من السقالة. إجراء ثقافة خلية قياسية مع خلع الخلايا الجذعية المشتقة. ثم رأيت الخلايا على السقالات الليفية وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

بعد ساعتين من الحضانة ، ضع المزيد من زراعة الخلايا على السقالات الليفية حتى يتم تغطيتها بشكل كاف في الوسط. ثم احتضان عينتين عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة وسبعة أيام على التوالي. هذه هي صور المجهر الإلكتروني الماسح التي تم التقاطها بزيادتين ملليمترين.

على السقالة. هناك تقدم واضح من الألياف المحاذاة إلى الألياف العشوائية على السقالة. تؤكد أنماط النقل السريع لمدة أربع سنوات على هذا التقدم حيث يشير النمط عند صفر ملليمترات إلى المحاذاة ، ويشير النمط عند ستة ملليمترات إلى اتجاه عشوائي من ثقافة الخلايا الجذعية.

تم التقاط مجموعتين من الصور المجهرية الفلورية. كلاهما يشير إلى اتجاهات خلوية مختلفة ، والتي يتم التوسط فيها من خلال موضع الخلايا الجالسة. على سقالة التحالف.

تظهر 70٪ من الخلايا في حدود 20 درجة من محور التصنيع مقارنة ب 20٪ فقط من الخلايا في الجزء العشوائي من السقالة. يتم فحص تكوين التدرج الكيميائي من خلال تغليف النانو بواسطة الصور المجهرية الفلورية. يظهر الرسم البياني لشدة الفلورسنت نموا خطيا يشير إلى تغير تدريجي في التركيز الكيميائي من خلال السقالة.

يمكن تغليف المواد الكيميائية مثل البروتين المورفوجيني للعظام الثاني بهذه الطريقة لتعزيز التمايز العظمي لهندسة الأنسجة ، فإن هدفنا النهائي هو تطوير بنية الأنسجة ، والتي ستجمع بين فئة فريدة من السقالات مع التدرجات المزدوجة في التنظيم الهيكلي والمحتوى المعدني. يمكن لهذا المزيج إعادة إنشاء الوتر الأصلي بالكامل لموقع إدخال العظام. يجب أن يسمح دمج بذر الخلايا الجذعية المشتقة من D بعد الإصلاح المعزز لإصابات الكفة المدورة.

قدمنا اليوم بروتوكول إنتاج سقالة من الألياف النانوية مع تدرج في الهيكل التنظيمي وشرحنا تطبيقاتها الطبية الحيوية المحتملة. الجزء الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو الترسيب الثانوي العشوائي على السقالة المحاذاة لإنشاء التدرج التنظيمي أثناء إعداد التدرج ، وراقب بعناية طرف الإبرة ويقوم المجمع بإزالة أي كرات عند طرف الإبرة أو ألياف غريبة في المجمع لضمان سقالة موحدة.