Name: تزامن العنيقاء Crescentus للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: تعلم مزامنة خلايا Caulobacter crescentus باستخدام الطرد المركزي التفاضلي الكثافة. تتيح هذه الطريقة عزل الخلايا السابحة لدراسة دورة حياة الخلايا البكتيرية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر شابيرو وإيرين شريدر على التعليقات على المخطوطة. يقر المؤلفون بالدعم المالي من: زمالة ما بعد الدكتوراه في المعاهد الوطنية للصحة F32 GM100732 إلى JMS ومنح المعاهد الوطنية للصحة R01 GM51426 و R01 GM32506 إلى LS.

1. على نطاق واسع التزامن - الأمثل لالبقعة الغربية، ميكروأري / RNA تسلسل، وغيره فحوصات مكثفة مواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من مخزون الثلاجة أو لوحة، وتنمو 5 مل O / N ثقافة سلالة NA1000 عن طريق هز في 28 ° C في PYE المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 0.5 مل من الخلايا من الخطوة 1 في 25 مل من M2G (الجداول 1-2) ويهز عند 28 درجة مئوية حتى تصل الثقافة إلى OD 600 بين 0.5 و 0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم الخلايا في 1 لتر من M2G ويهز في 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة OD 600 يصل 0،5-0،6، تأكد من وجود مخابئ الخلايا باستخدام السائل شنت المرحلة المجهري. بقعة 1 ميكرولتر من الخلايا على شريحة زجاجية، وتغطي مع انزلاق الغطاء، وصورة من المرحلة المجهري. تأكيد وجود خلايا مخابئ من خلال وضع تصور خلايا السباحة بسرعة بين السكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا لمدة 15 دقيقة في 7 kxg في 4 درجات مئوية في الدوار JA-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وإضافة 180 مل من M2 البارد (الجداول 1-2) والدقة بلطفuspend جميع الخلايا باستخدام الماصة المصلية. تجاهل الخلايا مكعبات فضفاضة. فهي خلايا predivisional ومطاردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 60 مل من البرد حل السيليكا الغروية (تأكد من خلط السيليكا تعليق صمغي جيدا قبل إضافة إلى الخلايا)، ومزيج تعليق خلية أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب تعليق خلية في ثمانية 30 مل أنابيب وتدور لمدة 30 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار. ملاحظة: يجب للمرء أن يرى شريطين مميزة؛ الفرقة مخابئ هي أقل الفرقة بينما مطاردة / خلايا predivisional هي في أعلى الفرقة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية الفرقة أعلى قبالة وإزالة السائل إلى ~ 1 سم فوق الفرقة مخابئ (أقل من الفرقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الحرجة) باستخدام الماصة باستور، وإزالة بعناية الفرقة مخابئ ووضع في أنبوب نظيفة. ليغسل السيليكا الغروية، أعلى الأنبوب قبالة مع M2 البارد وتدور لمدة 10 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بعناية طاف و resuspendالخلايا في 20 مل من M2 البارد وتدور لمدة 10 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend جميع الكريات في 30 مل من M2 البارد وقياس OD 600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي وفارغة باستخدام البارد المتوسطة M2. حفظ 1 ميكرولتر للمرحلة التصوير للتحقق من مخابئ الخلايا. يجب أن يكون 90-95٪ من خلايا swarmers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار خلايا لمدة 5 دقائق عند 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار. Resuspend الخلايا في 28 ° C M2G المتوسطة بحيث A 600 غير ~ 0.3-0.4 والبدء اهتزاز في 28 ° C. ملاحظة: غلة النموذجية هي ما بين 30 و 60ML من مخابئ ثقافة خلية من خلايا 1L غير المتزامنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء في اتخاذ نقاط زمنية (لن ​​ثقافة نوع البرية تأخذ حوالي 135-140 دقائق لتقسيم) 8،9. في كل نقطة زمنية، وقياس OD 600. تأكد من أن OD 600 بعد تقسيم ما يقرب من 2X وOD الأولي 600. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالغربية لطخة أو التعبير الجيني المقايسات، وإزالة مأخوذة من 1mL من مكعبlture عند نقاط الوقت المطلوب، وتدور إلى أسفل في أقصى سرعة في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 30 ثانية، وبسرعة صب أو نضح المتوسط، وفلاش تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل. تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية حتى تحليل المصب. </li></ol> 2. على نطاق صغير التزامن - الأمثل للالمجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من مخزون الثلاجة أو لوحة، وتنمو 5 مل O / N الثقافة تهتز عند 28 درجة مئوية في M2G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع في 15 مل من M2G (الجداول 1-2) وتنمو حتى سجل منتصف (OD 600 = 0.5-0.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 6.4 kxg لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار، وresuspend في 1 مل الباردة M2 (الجداول 1-2) ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 15 kxg لمدة 3 دقائق في أنبوب microcentrifuge لتكوير الخلايا، ونضح قبالة طاف، ووضع بيليه على الجليد، وresuspend في 900 ميكرولتر من M2 البارد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900 ميكرولتر من PVP البارد المغلفة السيليكا الغروية وتدور لمدة 20 دقيقة في 15 kxg في 4 درجات مئوية في هيئة التصنيع العسكريأنبوب rocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (الناقد) نضح أو الماصة قبالة رأس مطاردة / predivisional الفرقة الخلية وجمع أسفل مخابئ الفرقة في أنبوب microcentrifuge جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مخابئ مرتين في 1 مل من M2 البارد في حين الطرد المركزي في 15 kxg لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تدور النهائي، نقل الخلايا في قبل المبردة 1 مل اختبار أنبوب زجاجي وقياس OD 600 من الخلايا مقارنة فارغة من M2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية النهائي إلى 28 ° C M2G في لOD بين 0،3-0،4 ويهز خلية / لفة في 28 ° C. ملاحظة: غلة النموذجية هي ما بين 2 و 4 مل من ثقافة الخلية مخابئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب المجهري، في مكان المطلوب نقاط زمنية 1 ميكرولتر من الخلايا على لوحة agarose M2G للتصوير. </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
<li>Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetics of Caulobacter crescentus.</a> Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).</li>
<li>Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpXP+and+ClpAP+proteolytic+activity+on+divisome+substrates+is+differentially+regulated+following+the+Caulobacter+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division.</a> Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).</li>
<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

دورة الخلايا البكتيرية هي عملية أساسية في الحياة وهي مهمة لدراسة النمو وكهدف للجيل التالي من المضادات الحيوية. هنا ، قمنا بتفصيل إجراءات المزامنة السريعة ل C. crescentus NA1000 ، وهو كائن حي نموذجي لدراسة دورة الخلية البكتيرية وانقسام الخلايا غير المتماثل. هذه الطريقة قابلة للتعديل إلى اللطخة الغربية ، وتوصيف التعبير الجيني ، ومقايسات الفحص المجهري الفلوري للتحقيق في التنظيم الزماني المكاني لدورة الخلية البكتيرية. 
البروتوكول سريع وينتج عنه خلايا متزامنة صحية. تتطلب طرق المزامنة الأ...

تسيطر على دورة الخلية البكتيرية كل من تكرار الجينوم وتقسيم الخلايا الوليدة. الأهم من ذلك، كما مقاومة المضادات الحيوية تشكل تهديدا متزايدا على الصحة العامة، تقدم دورة الخلية البكتيرية هدفا غير مستغلة للتنمية المضادات الحيوية. في بكتيريا العنيقاء crescentus، كل دورة الخلية يؤدي إلى تقسيم غير المتماثلة، مما أسفر عن خليتين ابنة مصائر مختلفة (الشكل 1A) 1،2. خلية ابنة واحدة يرث السوط وهي متحركة في حين أن ابنة أخرى يرث ساق وهي اطئة. دائرة الوراثية متكاملة تسيطر تقدم دورة الخلية ومصير الخلية عن طريق تنظيم النسخي، الفوسفات، مما يشير، والتحلل البروتيني المنظم 3. وبالإضافة إلى ذلك، وتكرار كروموسوم وخلايا ابنة العائد الفصل المتزامنة التي تحتوي بالضبط نسخة واحدة من كروموسوم 4. الأهم من ذلك، هذه أنواع الخلايا اثنين يمكن فصلها بسرعة عن طريق كولوايدال السيليكا الجسيمات كثافة الطرد المركزي في سلالة synchronizable NA1000 5-7 السماح للعزل الخلايا مخابئ عن بقية السكان مع عوائد عالية (الشكل 1B). عزل مخابئ خلايا ثم المضي قدما بشكل متزامن من خلال انقسام الخلايا غير المتماثلة. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول يستخدم لمزامنة العنيقاء سلالة NA1000. ونحن نقدم البروتوكولات ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها المشتركة لكلا الكبيرة والصغيرة الحجم تزامن. يوفر هذا الإجراء التجريبي أداة قوية لاستجواب السيطرة الزمانية المكانية من دورة الخلية العنيقاء ومصير الخلية.

<table><tbody><tr><td>السيليكا الغروية المطلية ب PVP (بيركول)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>السيليكا الغروية (Ludox AS-40)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 الدوار</td><td>بيكمان كولتر</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 الدوار</td><td>بيكمان كولتر</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>محلول مخلب كبريتات الحديدوز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الطرد المركزي 30 مل</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na 2HPO 4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

تزامن<em&gt; العنيقاء crescentus</em&gt; للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

دورة الخلية مهمة للنمو وتكرار الجينوم والتطور في جميع الخلايا. في البكتيريا ، ركزت دراسات دورة الخلية إلى حد كبير على الخلايا غير المتزامنة مما يجعل من الصعب ترتيب الأحداث الزمنية المطلوبة لتقدم دورة الخلية ، وتكرار الجينوم ، والانقسام. يوفر الهلال الكرسي نظاما نموذجيا ممتازا لدورة الخلية البكتيرية حيث يمكن مزامنة الخلايا بسرعة في حالة G0 عن طريق الطرد المركزي الكثافة. تم استخدام تجارب تزامن دورة الخلية لإنشاء الأحداث الجزيئية التي تحكم تكرار الكروموسوم وفصله ، لرسم خريطة لشبكة تنظيمية وراثية تتحكم في تقدم دورة الخلية ، ولتحديد إنشاء مجمعات الإشارات القطبية المطلوبة لانقسام الخلايا غير المتماثل. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا للمزامنة السريعة لخلايا Caulobacter NA1000. يمكن إجراء التزامن بتنسيق واسع النطاق لتنميط التعبير الجيني ومقايسات اللطخة الغربية ، بالإضافة إلى تنسيق صغير النطاق للفحص المجهري أو فحوصات FACS. إن قابلية التزامن السريعة وإنتاجية الخلايا العالية للكولوباكتر تجعل هذا الكائن الحي نظاما نموذجيا قويا لدراسات دورة الخلية البكتيرية.

تزامن عادة ينتج شريطين من الخلايا (الشكل 1B): الفرقة مخابئ، والتي لديها أعلى كثافة، ومطاردة / predivisional الفرقة خلية من أقل كثافة. لضمان وتشمل الضوابط المشتركة تزامن كفاءة مراقبة OD 600 وقياس مستويات البروتين CTRA التي كتبها طخة غربية في نقاط متميزة الوقت دورة الخلية. وOD 600 يجب زيادة بنحو 2 أضعاف خلال دورة الخلية (الشكل 2). لطخة غربية لدورة الخلية منظم سيد CTRA هو السيطرة مفيدة للتحقق من التزامن جيد (الشكل 2).</s...

تزامن الخلايا البكتيرية ضروري لدراسات دورة الخلية البكتيرية وتطورها. الهلال الرديبي قابل للمزامنة من خلال الطرد المركزي الكثافة مما يسمح بأداة سريعة وقوية لدراسات دورة الخلية البكتيرية. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لمزامنة خلايا الكرس.

تزامن<em&gt; العنيقاء Crescentus</em&gt; للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا Coob backer السابحة (swarmer cells) من أجل إنشاء مستنبت خلوي متزامن. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنمية مستنبت مختلط من خلايا coob backer، ثم إيقاف النمو لفترة وجيزة عن طريق إعادة تعليق الخلايا في وسط بارد. وتتمثل الخطوة الثانية في فصل الخلايا السابحة من خلال الطرد المركزي بكثافة تفاضلية.تتمثل الخطوة التالية في إعادة تعليق خلايا السرب في وسط دافئ، مما يسمح للخلايا بدخول الدورة الخلوية. وأخيرًا، يمكن تتبع خلايا السرب المعزولة طوال الدورة الخلوية باستخدام المقاييس البيوكيميائية أو المجهر. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل جهاز الخلايا الصغيرة (baby cell machine)، في إمكانية عزل الخلايا بسرعة وتكثيرها بكميات كافية للدراسات البيوكيميائية.يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الخلية، مثل العوامل التي تتحكم في فصل الكروموسومات ودورة انقسام الخلية غير المتماثل. للبدء، قم بتلقيح 5 mL من وسط PYE ببكتيريا من طبق من سلالة colo backer CSIS، NA 1000. قم بتنمية المزرعة طوال الليل عند 28 °C مع الرج، وفي اليوم التالي، انقل 0.5 mL من المزرعة الليلية إلى دورق يحتوي على 25 mL من وسط M two G، ورج الدورق عند 28 °C حتى تصل الكثافة الضوئية للمزرعة إلى ما بين 0.5 و0.6.بعد ذلك، خفف المزرعة في لتر واحد من وسط M two G للحصول على الكثافة الضوئية الابتدائية المطلوبة، ورج القارورة عند درجة حرارة 28 °C. عندما تصل الكثافة الضوئية للمزرعة إلى 0.5، انقل 1 µL من المزرعة إلى شريحة، ثم غطِّ السائل بغطاء شريحة. صوّر الخلايا باستخدام مجهر تباين الطور للتأكد من وجود خلايا السرب سريعة السباحة. انقل المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي معقم، ثم قم بدوران الخلايا عند 7,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.بعد ذلك، تخلص من الخلايا المترسبة بشكل فضفاض عند سكب الطافي، وأضف 180 milliliters من وسط M two البارد. استخدم ماصة سيرولوجية لإعادة تعليق الخلايا برفق. ثم أضف 60 milliliters من محلول السيليكا الغروية البارد إلى معلق الخلايا واخلط جيداً.صب معلق الخلايا في ثماني أنابيب سعة 30 milliliter واجعلها تدور في جهاز الطرد المركزي بسرعة 6, 400 ×g لمدة 30 دقيقة. اضبط درجة الحرارة على أربع درجات Celsius. أخرج الأنابيب برفق من جهاز الطرد المركزي وافحص الأنبوب للتأكد من وجود نطاقين متميزين.تحتوي الحزمة السفلية على الخلايا السابحة (swarmer cells)، بينما تتواجد الخلايا ما قبل الانقسام في الحزمة العلوية. بعد ذلك، قم بسحب الحزمة العلوية والسائل الموجود فوق الحزمة السفلية بمسافة سنتيمتر واحد تقريبًا بعناية. استخدم ماصة باستير لإزالة حزمة الخلايا السابحة ونقلها إلى أنبوب نظيف.املأ الأنبوب بوسط M two البارد، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً لغسل السيليكا الغروية. بعد ذلك، تخلص بعناية من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 20 milliliters من وسط M two البارد. قم بالطرد المركزي مرة أخرى لترسيب الخلايا، ثم أعد تعليق الراسب في 30 milliliters من وسط M two البارد، وبعد ذلك قم بقياس الكثافة الضوئية للمعلق.ضع ميكرولتر واحد من معلق الخلايا على شريحة مجهرية واستخدم التصوير الطوري للتحقق من وجود خلايا السرب. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً وإعادة تعليقها في وسط M two G لتصل الكثافة الضوئية إلى ما بين 0.3 و 0.4. قم بحضن المزرعة مع الرج عند 28 درجة Celsius من أجل اختبارات لطخة ويسترن أو مقاييس التعبير الجيني.قم بسحب عينات بحجم 1مل كل 10 إلى 30 دقيقة لمدة 140 دقيقة تقريباً حتى تتضاعف الكثافة الضوئية للمزرعة. استخدم جهاز طرد مركزي مكتبي لترسيب الخلايا لمدة 30 ثانية، ثم اسحب الوسط الغذائي بسرعة. قم بتجميد كتل الخلايا في النيتروجين السائل واحفظها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. ولإجراء عملية المزامنة على نطاق صغير، قم بتلقيح 5مل من وسط M2G بـ NA1000 من الخلايا، واترك الخلايا تنمو طوال الليل مع الرج عند درجة حرارة 28 درجة مئوية حتى اليوم التالي.قم بتخفيف المزرعة في 15 milliliters من وسط M two G ونمِّ الخلايا حتى تتراوح الكثافة الضوئية بين 0.5 و 0.6. قم بطرد الخلايا مركزياً ثم أعد تعليقها في 1 milliliter من وسط M two البارد. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 milliliter، وقم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي ثم اسحب السائل العلوي.ثم ضع الأنبوب على الثلج وأعد تعليق كتلة الخلايا في 900 µL من وسط M two البارد. بعد ذلك، أضف 900 µL من السيليكا الغروية المغلفة بـ PVP الباردة، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة 20 دقيقة. اسحب بعناية حزمة الخلايا العلوية سابقة الانقسام، ثم اجمع حزمة الخلايا السابحة السفلية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.اغسل الخلايا السابحة (swarmer cells) مرتين في 1 mL من وسط M2 البارد، مع إجراء عملية الطرد المركزي لمدة 3 دقائق بين كل غسلة وقبل الدورة النهائية مباشرةً. ضع معلق الخلايا في أنبوب اختبار زجاجي سعة 1 mL مبرد مسبقاً وقس الكثافة الضوئية للخلايا. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (microfuge tube) واجرِ عملية الطرد المركزي.يا ريس، قم بتعليق كتلة الخلايا النهائية في وسط Prewarm M two G بكثافة بصرية تتراوح بين 0.3 و 0.4 ورج الخلايا عند درجة حرارة 28 °C. في حال الرغبة في إجراء الفحص المجهري، ضع 1 µL من المزرعة على وسادة M two G aeros في النقاط الزمنية المناسبة. يؤدي الطرد المركزي بكثافة تفاضلية لمزرعة غير متزامنة إلى ظهور نطاقين من الخلايا.تحتوي النطاق السفلي على خلايا السرب (swarmer cells)، والتي تتميز بكثافة أعلى، بينما يحتوي النطاق العلوي على الخلايا المخزنة (stocked cells) والخلايا ما قبل الانقسام، والتي تتميز بكثافة أقل. وتزداد الكثافة الضوئية للمزرعة بنحو ضعفين تقريباً خلال دورة الخلية. وخلال هذه الفترة، تتمايز خلايا السرب إلى خلايا مخزنة، ثم تتضاعف الخلايا المخزنة وتخضع لانقسام خلوي غير متماثل.بما أن كل عملية انقسام تنتج خلية سابحة (swarmer cell) جديدة وخلية أصلية مخزنة (stocked cell)، فإن تحليل لطخة ويسترن (western blot) للمنظم الرئيسي لدورة الخلية CTRA يعد ضابطاً مفيداً للتحقق من التزامن؛ حيث يقوم CTRA بتثبيط تضاعف DNA في الخلايا السابحة ويتم تحلله عند بدء تضاعف DNA. ثم يتم تخليق CTRA لاحقاً في دورة الخلية لمنع إعادة بدء تضاعف DNA وتنشيط نسخ العديد من الجينات التنموية. ويشير هذا النمط المتذبذب لمستويات بروتين CTRA إلى نجاح عملية التزامن.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية مزامنة خلايا callback أو NA 1000 لدراسة دورة حياة الخلية البكتيرية. يمكن إتمام إجراء مزامنة الخلايا هذا في غضون ساعة إلى ساعتين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. ومن المهم عند تنفيذ هذا الإجراء تذكر العمل بسرعة.

synchronization-caulobacter-crescentus-for-investigation-bacterial

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وذكرت ونحن في الآونة الأخيرة نهجا جديدا لتوليد تحقيقات DNAzyme fluorogenic التي يمكن تطبيقها لاقامة بسيطة، "مزيج والقراءة" فلوري فحص للكشف عن البكتيريا. هذه التحقيقات DNA خاص تحفيز الانقسام من الحمض النووي الريبي الركيزة حامل اللون معدلة وخيالية في وجود مزيج النفط الخام خارج الخلية (CEM) التي تنتجها بكتيريا معينة، وترجمة وبالتالي اكتشاف بكتيريا في توليد إشارة مضان. في هذا التقرير سنقوم بشرح الإجراءات التجريبية الرئيسية التي يعمل تحقيقا DNAzyme محددة تدل على "تكتل القوى الديمقراطية، EC1" للكشف...

الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic

يوصف تصميم ترميز OPERON الاصطناعية على حد سواء جهاز إفرازية ومونومرات الهيكلية من ألياف curli. الافراط في هذه اميلويدس والبوليمرات تمسكا يسمح مكسب للقياس الانضمام...

الهندسة البكتيريا تمسكا من إنشاء واحدة الاصطناعية Curli OPERON

المصدر: موراتا ، ك. وآخرون ، تصور ضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بواسطة التصوير المقطعي بالإلكترون بالتبريد عالي الجهد. J. Vis. خبرة. (2018)يوضح هذا الفيديو الزراعة المتزامنة للبكتيريا الزرقاء في ظل دورات الضوء والظلام لدراسة ضغط الحمض النووي الذي ينظمه الساعة البيولوجية. يكشف الفحص المجهري الفلوري عن الحمض النووي المكثف في نقاط زمنية محددة ، مما يؤكد محاذاة دورة الخلية عبر السكان.

تزامن ثقافة البكتيريا الزرقاء وضغط الحمض النووي مدفوع بدورات الضوء والظلام

فهم وظيفة العمليات الأساسية في البكتيريا هو التحدي. مجهر الأسفار مع صبغات محددة الهدف يمكن أن توفر أفكاراً رئيسية في تطور النمو ودورة الخلية الخلية الجرثومية. هنا، tumefaciens المتبعة بكتيريا نموذجي لتسليط الضوء على أساليب لتصوير الخلايا الحية لوصف العمليات الأساسية.

يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

ويتم تنظيم الخلايا البكتيرية مكانياً عاليا. لمتابعة هذه المنظمة على مر الزمن في بطء تزايد الخلايا إكسانثوس ميكسوكوككوس ، قد وضعت إعداد لتصوير خلية يعيش الأسفار مع ارتفاع القرار الزمانية المكانية على مدى عدة أجيال. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن تحديد الديناميات الزمانية المكانية من البروتينات الهامة للعزل الصبغي وانقسام الخلية.

الأسفار خلايا حية تصوير "دورة الخلية الخضري كاملة" من "بكتيريا الاجتماعية" بطيئة النمو إكسانثوس ميكسوكوككوس

الموصوفة هنا أسلوب لتحليل تعبير الجينات البكتيرية في الأنسجة الحيوانية على مستوى خلوي. هذا الأسلوب يوفر موردا لدراسة التنوع المظهرية التي تحدث داخل سكان بكتيرية في الاستجابة للبيئة الأنسجة أثناء عدوى.

أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة

توفر هذه المقالة دليل خطوه بخطوه للتحقيق في ديناميات التعريب الخلوية البروتينية ومراقبه التغييرات المورفولوجية باستخدام المجهر عالي الدقة الفلورية في العصي الفرعية والمكورات العنقودية الذهبية.

المجهرية الخلوية التفاعلية للتحقيق في توطين البروتين تحت الخلوي والتغيرات في الخلايا المورفولوجية في البكتيريا

يقدم هذا العمل طريقة المجهر التي تسمح بالتصوير الحي لخلية واحدة من الإشريكية القولونية لتحليل وتكميم السلوك العشوائي للدوائر الجينية الاصطناعية.

القياس المستمر للضوضاء البيولوجية في الإشريكية القولونية باستخدام المجهر الفاصل الزمني

تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

يصف ثبات المضادات الحيوية قدرة المجموعات السكانية الفرعية الصغيرة داخل مجموعة سكانية حساسة متساوية المنشأ على تحمل جرعات عالية من المضادات الحيوية المبيدة للجراثيم بشكل عابر. يجمع البروتوكول الحالي بين مناهج لتوصيف النمط الظاهري لاستمرار المضادات الحيوية على المستويين الجزيئي والخلوي بعد تعريض الإشريكية القولونية لجرعات مميتة من أوفلوكساسين.

تحليل السكان والخلية المفردة لاستمرار المضادات الحيوية في الإشريكية القولونية

يتمثل أحد تحديات تحليل تجارب السلاسل الزمنية المتزامنة في أن التجارب غالبا ما تختلف في طول فترة التعافي من التزامن وفترة دورة الخلية. وبالتالي ، لا يمكن تحليل القياسات من التجارب المختلفة بشكل إجمالي أو مقارنتها بسهولة. نصف هنا طريقة لمواءمة التجارب للسماح بإجراء مقارنات خاصة بالطور.

محاذاة بيانات السلاسل الزمنية المتزامنة باستخدام توصيف فقدان نموذج تزامن دورة الخلية للمقارنات عبر التجارب

تعلم مزامنة خلايا Caulobacter crescentus باستخدام الطرد المركزي التفاضلي الكثافة. تتيح هذه الطريقة عزل الخلايا السابحة لدراسة دورة حياة الخلايا البكتيرية بدقة عالية.

تزامن

استكشف المزيد من الفيديوهات