تزامن العنيقاء Crescentus للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل خلايا السرب الداعم Coob من أجل إنشاء ثقافة خلوية متزامنة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة ثقافة مختلطة من الخلايا الداعمة للكوب أولا ، ثم إيقاف النمو لفترة وجيزة عن طريق تعليق الخلايا في وسط بارد. الخطوة الثانية هي فصل الخلايا السرب من خلال الطرد المركزي الكثافة التفاضلية.

الخطوة التالية هي إعادة تعليق خلايا السرب في وسط دافئ ، مما يسمح للخلايا بالدخول إلى دورة الخلية. أخيرا ، يمكن متابعة خلايا السرب المعزولة طوال دورة الخلية باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية أو الفحص المجهري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى ، مثل آلة الخلايا الصغيرة ، هي أنه يمكن عزل الخلايا بسرعة وتكبير كميات كافية للدراسات الكيميائية الحيوية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، مثل ما يتحكم في فصل الكروموسومات ودورة انقسام الخلية غير المتماثلة. للبدء في تلقيح خمسة ملليلتر من وسط PYE بالبكتيريا من صفيحة من سلالة CSIS الداعمة للكولو ، NA 1000. قم بزراعة المزرعة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية مع الرج في اليوم التالي ، وانقل 0.5 مل من المزرعة الليلية إلى قارورة تحتوي على 25 مل من متوسط M two G ، ورج القارورة عند 28 درجة مئوية حتى تصل المزرعة إلى كثافة بصرية بين 0.5 و 0.6.

بعد ذلك ، قم بتخفيف المزرعة إلى لتر واحد من متوسط M two G للحصول على الكثافة البصرية المطلوبة للبدء ورج القارورة عند 28 درجة مئوية عندما تصل الكثافة الضوئية للثقافة إلى 0.5 ماصة ميكرولتر واحد من المزرعة على شريحة ، ثم قم بتغطية السائل بقلة غطاء. قم بتصوير الخلايا عن طريق الفحص المجهري الطوري لتأكيد وجود خلايا سرب سريعة السباحة. انقل المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي معقم ثم قم بتدوير الخلايا عند 7 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، تخلص من الخلايا المحببة بشكل فضفاض عند سكب المادة الطافية وأضف 180 مل من البارد M اثنين من المتوسط. استخدم ماصة مصلية لإعادة تعليق الخلايا برفق. ثم أضف 60 مل من محلول السيليكا الغروية البارد إلى تعليق الخلية واخلطه جيدا.

صب معلق الخلية في ثمانية أنابيب سعة 30 مليلتر وقم بطردها في 6 ، 400 مرة G لمدة 30 دقيقة. اضبط أربع درجات مئوية. قم بإزالة الأنابيب برفق من جهاز الطرد المركزي وفحص الأنبوب بحثا عن شريطين متميزين.

يحتوي النطاق السفلي على الخلايا المسببة والخلايا قبل الانقسام في النطاق العلوي. بعد ذلك ، قم بشفط الشريط العلوي والسائل بعناية حتى سنتيمتر واحد تقريبا فوق النطاق السفلي. استخدم ماصة لصق لإزالة شريط السرب ونقله إلى أنبوب نظيف.

املأ الأنبوب بمتوسط M اثنين بارد ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب لغسل السيليكا الغروية. بعد ذلك ، تخلص بعناية من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 20 مل من أجهزة الطرد المركزي الباردة M اثنين من أجهزة الطرد المركزي المتوسطة. مرة أخرى لحبيبات الخلايا ، أعد تعليق الكريات في 30 مل من البارد M اثنين من الوسط ، ثم قم بقياس الكثافة البصرية للتعليق.

ضع ميكرولتر واحد من معلق الخلية على شريحة مجهرية واستخدم تصوير الطور للتحقق من وجود خلايا سرب. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليقها في متوسط M two G إلى كثافة بصرية تتراوح بين 0.3 و 0.4. احتضان الثقافة بالاهتزاز عند 28 درجة مئوية لفحوصات الحبكة الغربية أو التعبير الجيني.

قم بإزالة مليلتر واحد من الحصص كل 10 إلى 30 دقيقة لمدة 140 دقيقة تقريبا حتى تتضاعف الكثافة البصرية للثقافة. استخدم جهاز طرد مركزي منضدي لتدوير الخلايا لمدة 30 ثانية ثم شفط الفلاش المتوسط بسرعة. قم بتجميد كريات الخلية في النيتروجين السائل وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية لالتزامن على نطاق صغير ، وتلقيح خمسة ملليلتر من متوسط M two G بخلايا NA 1000 وقم بزراعة الخلايا طوال الليل مع الاهتزاز عند 28 درجة مئوية في اليوم التالي.

خفف المزرعة في 15 مل من متوسط M two G وقم بتنمية الخلايا حتى تتراوح الكثافة الضوئية بين 0.5 و 0.6. الطرد المركزي الخلايا ثم إعادة تعليقها في ملليلتر واحد من البارد M اثنين من المتوسط. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترين ، وحبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي وشفط الأنبوب الطبيعي.

ثم ضع الأنبوب على الجليد وأعد تعليق حبيبات الخلية في 900 ميكرولتر من البارد M اثنين من المتوسط. بعد ذلك ، أضف 900 ميكرولتر من السيليكا الغروية المطلية ب PVP على البارد ، وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 20 دقيقة. قم بسحب نطاق الخلية العلوي قبل الانقسام بعناية ثم اجمع شريط السرب السفلي في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

اغسل خلايا السرب مرتين في مليلتر واحد من البارد M اثنين من الوسط أثناء الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق بين كل غسلة قبل الدوران النهائي مباشرة. ضع معلق الخلية في أنبوب اختبار زجاجي مبرد مسبقا بسعة مليلتر واحد وقم بقياس الكثافة البصرية للخلايا. ثم انقل الخلايا إلى أنبوب fuge دقيق وجهاز طرد مركزي بعد الترميز المركزي.

ريس ، قم بتعليق حبيبات الخلية النهائية في وسط Prewarm M two G بكثافة بصرية بين 0.3 و 0.4 وقم بهز الخلايا عند 28 درجة مئوية. إذا كان الفحص المجهري مطلوبا ، فضع ميكرولتر واحد من المزرعة على وسادة M two G aeros في النقاط الزمنية المناسبة. ينتج عن الطرد المركزي للكثافة التفاضلية للثقافة غير المتزامنة شريطين من الخلايا.

الشريط السفلي على خلايا سرب ذات كثافة أعلى ، ويحتوي الشريط العلوي على خلايا مخزنة وما قبل الانقسام ، والتي لها كثافة أقل. تزداد الكثافة البصرية للثقافة بمقدار الضعف تقريبا خلال دورة الخلية. خلال هذا الوقت ، تتمايز خلايا السرب إلى خلايا مخزنة ، ثم تتكاثر الخلايا المخزنة وتخضع لانقسام الخلايا غير المتماثل.

مع كل قسم ينتج عنه خلية سرب جديدة وخلية مخزنة أصلية ، فإن اللطخة الغربية للمنظم الرئيسي لدورة الخلية CTRA هي عنصر تحكم مفيد للتحقق من التزامن ، حيث يمنع CTRA تكرار الحمض النووي في الخلايا الجماعية ويتحلل عند تكرار الحمض النووي. ثم يتم تصنيع CTRA لاحقا في دورة الخلية مما يمنع إعادة استنساخ الحمض النووي وتنشيط نسخ العديد من الجينات التنموية. يشير هذا النمط المتذبذب لمستويات بروتين CTRA إلى تزامن ناجح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مزامنة معاودة الاتصال أو خلايا NA 1000 للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية. يمكن إجراء مزامنة الخلية هذا في غضون ساعة إلى ساعتين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة.