بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج Medicago truncatula

الهدف العام من الإجراءات التالية هو توضيح عدد أجنة تولا البضائع التي يمكن الحصول عليها في مراحل النمو المختلفة للتحقيق في التنظيم الجيني للتطور الجنيني في النباتات ، ويمكن تحقيق ذلك من خلال ربط مورفولوجيا القرون بمراحل نمو الجنين الزيجوتي المختلفة ، ومن خلال زراعة الأوراق للحصول على أجنة جسدية في المراحل المختلفة. في النهاية ، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وبيتا جلوكورونيداز لتقييم التعبير عن الجينات أثناء التطور الجنيني في مراحل النمو المحددة ذات الأهمية. تتمثل مزايا هذه التقنيات في أن وضع علامات على الزهور الفردية غير مطلوب للتجارب في الجسم الحي ، ويتم تحسينها في الإجراءات المختبرية ، وتوفر مناهج تجريبية مجانية.

العرض المرئي لإجراء الثقافة أمرا مهما لأنه يسمح بمتابعة تفاصيل التلاعب عن كثب. وإظهار الإجراء في الجسم الحي سيكون وانغ في حين أن كيم نولان سوف يعرض في المختبر الإجراء. لتسهيل نمو الجنين الزيجوتي ، اخترق سطح طبقات البذور من نبات ثلاثي العينيات في مونتي البضائع وانقع البذور طوال الليل ، مغطاة بالكامل بالماء.

في اليوم التالي ، قم بزرع ثلاث بذور في كل من 10 أواني قطرها 15 سم في خليط تأصيص وانقل الأواني إلى منزل زجاجي. قم بزراعة النباتات في فترة تصوير مدتها 14 ساعة بدرجة حرارة تتراوح من 23 إلى 19 درجة مئوية ليلا ونهارا ، مع الاحتفاظ بالشتلات الأكثر صحة بعد الإنبات بحيث يكون هناك نبتة واحدة لكل إناء وتحيط بالشتلات بتعريشة حتى تتسلق سيقان النبات عند ظهور القرون. اجمع في المراحل المناسبة الموضحة في الجدول الأول والشكل الأول للحصول على مرحلة نمو الجنين المبكرة المرغوبة.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لعزل les عن القرون. بدلا من ذلك ، للحصول على فحص مجهري أكثر دقة ، واضح تماما في محلول هوير ، يمكن تأكيد مراحل الجنين عن طريق تصوير الأجنة تحت مجهر مركب قياسي. ثم اجمع عدد UL المطلوب للتجربة من المنطقة الوسطى من الكبسولة وقم بتخزينها في درجة الحرارة المناسبة لتحليل المصب لنمو الجنين الجسدي.

في المختبر ، نشرات الحصاد من أحدث أوراق تيت الموسعة بالكامل تقريبا لجذع ممدود لصنف tran atula القادر على تكوين أجنة بسهولة في الثقافة. احتفظ بأوراق التيت على منشفة ورقية مبللة في إناء ثقافة لتجنب الجفاف. ثم العمل في خزانة السلامة الحيوية المعقمة بالأشعة فوق البنفسجية ، ووضعت الأوراق في الكرة الشبكية لمصفاة شاي الربيع الأوتوكلاف.

مصفاة مغمورة في 70٪ من الإيثانول في غطاء لولبي الأوتوكلاف سعة 250 مل. وعاء استزراع البولي كربونات بعد 30 ثانية ، قم بتصريف أنسجة الأوراق ثم اغمر المصفاة في محلول مبيض مخفف من واحد إلى ثمانية لمدة 10 دقائق. مع الدوران اللطيف من حين لآخر ، حرك القدر برفق وصفي الماء الزائد.

ثم اشطف المصفاة. مرة أخرى في ماء عذب منزوع الأيونات في وعاء جديد. استخدم الآن ملقطا معقما لنقل الأوراق من مصفاة الشاي إلى مزرعة جديدة ، وعاء من المسمار المقطر المعقم منزوع الأيونات على الغطاء المعقم.

ثم شطف الأوراق عن طريق الانعكاس والدوران. ثم اسمح للمنشورات أن تطفو على الماء المعقم لألواح الغرسات. تقليم حواف المنشورات المعقمة الفردية باستخدام تقنية معقمة.

ثم قم بتقطيع المستطيل المتبقي إلى اثنين أو ثلاثة ، من ثمانية إلى 10 × ثلاثة إلى خمسة ملم مستطيل مع منتصف الوريد في وسط كل لوحة X. ستة × مكثفات لكل وسط استزراع صلب أجار بقطر تسعة سنتيمترات. أطباق بتري مع جانب ختم ABA لأسفل للحفاظ على اتجاه الورقة المعتاد.

ثم أغلق أطباق بتري بالبيرفيل واحتضن الأطباق في الظلام عند 28 درجة مئوية في غرفة درجة حرارة يتم التحكم فيها. بعد ثلاثة أسابيع ، استخدم ملعقة وملقط معقمة من الفولاذ المقاوم للصدأ لزراعة نباتات الثقب المتمايز على وسط جديد. يجب ملاحظة الأجنة الأولى في غضون أربعة أسابيع تقريبا عند حدوث التصلب ، ويتجاوز الكالس حجم أكبر مخطط موضح هنا.

انقل 50٪ فقط من الكالس الفردي عند الزراعة الفرعية إلى وسط جديد. أخيرا ، استخدم مجهر استريو لجمع مراحل الجنين المختلفة على مدار فترة حضانة تتراوح من أربعة إلى ثمانية أسابيع ، ومعالجة الآلات المكسرة وفقا للأهداف التجريبية. بعد حصاد الأجنة البيجوتية كما هو موضح للتو في اتجاه مجرى النهر في C ، يمكن استخدام اثنين من التهجين أو غيرها من الاستراتيجيات المناسبة ذات الأهمية الخاصة كما هو موضح في هذه الصور ، يمكن ملاحظة تميز SSIS و Spencer باتباع خطط X المطلية.

خلال الأسابيع ، يمكن تحديد موقع أربعة إلى ثمانية أجنة جسدية في مراحل سرية واختيارها لتحليلها الفوري. على سبيل المثال ، توضح هذه البيانات كيف تظهر الأجنة في مرحلة الأولين المبكرة التعبير عن نوع واحد من جين Medicago Tula eoin ، ولكن ليس آخر. ميزة خاصة لنظام الجنين الجسدي هي أن تحويل الكالس يمكن إجراؤه دون تجديد نبات كامل.

في الواقع ، كما هو موضح هنا. يمكن استخدام Beta glucuronidase لتصور التعبير الجيني في مراحل مختلفة من التطور الجنيني. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختيار الجراب وتفكيكه للحصول على أندريس.

يجب أن يكون لديك أيضا فهم جيد لكيفية التحضير ولوحة المسح المعقم للتطور الجنيني الجسدي بعد تطورها. مكنت هذه التقنيات من التحقيق في تنظيم النسخ للمراحل المبكرة من التطور الجنيني فيما يتعلق بنمو الأجنة وتخزين المغذيات.