Name: التصوير تستقيم من ذبابة الفاكهة غرف البيض (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: اكتشف طريقة التصوير العمودي لغرف بيض ذبابة الفاكهة باستخدام المجهر الضوئي المجهري. تُظهر هذه التقنية التنظيم الخلوي والتحت خلوي للأقطاب بوضوح عالٍ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن نقدر المساعدة المقدمة من أعضاء مجتمع الذباب ، ولا سيما الدكتورة دينيس مونتيل ، والدكتورة لين كولي ، والدكتور بيرنيل رورث ، للكواشف. نشكر Flybase ، ومركز Bloomington Tذبابة الفاكهة ، وبنك الدراسات التنموية Hybridoma على المعلومات وتوفير مخزون الذباب والأجسام المضادة ، على التوالي. يتم دعم LM من قبل منحة وزارة التعليم ، وزمالة تدريب مساعدة الخريجين في مجالات الاحتياجات الوطنية (GAANN) (P200A120017) ومن خلال مبادرة NIGMS لتعظيم منحة تنمية الطلاب (2 R25-GM55036). تم دعم جزء من أعمال الفحص المجهري من خلال منحة التصوير بالرنين المغناطيسي NSF DBI-0722569 ومرفق Keith R. Porter Core Imaging Facility. تم دعم البحث جزئيا من خلال جائزة NSF CAREER (1054422) وجائزة Basil O'Connor Starter Scholar من March of Dimes ، وكلاهما منح ل MSG.

1. تشريح Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حوالي خمسة عشر الذباب الإناث القديمة 2-4 يوما وعدد قليل من الذكور لذبابة القارورة الغذاء الطازج مع إضافة الخميرة الجافة النشطة. استخدام القطن باعتبارها المكونات لقارورة، وإضافة بضع قطرات من الماء إلى القطن للحفاظ على رطوبة عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قارورة في C حاضنة 25 درجة ل14-16 ساعة لتحقيق أقصى قدر من عدد من المرحلة 8-10 غرف البيض. ملاحظة: فترة حضانة يختلف باختلاف درجة الحرارة والمرحلة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام تشريح، 0.1M KPO 4 و NP40 الحلول حسب الحاجة لليوم التالي (انظر المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب باستخدام CO 2، ووضع تحت المجهر تشريح. الماصة عدة قطرات من وسائل الإعلام تشريح في كل تجويف في الشريحة الزجاجية الاكتئاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد ملقط في كل يدوية على ما يقرب من 30 درجة زاوية إلى الأعلى الطاولة وتوجيه ذبابة واحدة أنثوية الأجنحة إلى أسفل. مع جهة غير المهيمنة الخاص بك، والتقاط الأنثى باستخدام ملقط، واستيعاب لها في لnterior من البطن، بالقرب من القفص الصدري، وغمر لها في وسائل الإعلام تشريح في الشريحة الاكتئاب (الشكل 1A الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج آخر من ملقط، فهم الهيكل الخارجي في الخلفية البطنية من البطن ويخترق من خلال. الاستيلاء على المبايض في نهاية الخلفي، ثم سحب لهم للخروج من البطن ووضعه في وسائل الإعلام الطازجة على الجانب الآخر من الشريحة الاكتئاب. (الشكل 1A الشكل). تجنب سحب بعيدا القناة الهضمية. تجاهل الذبيحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر مع غيرها من الذباب الإناث حتى يتم تشريح جميع المبايض. تجاهل الذكور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج واحد من ملقط، عقد المبيض في نهاية الخلفي (بالقرب من أكبر غرف البيض)، وباليد الأخرى استخدام زوج من ملقط لقرصة إحدى الغرف البيض الأكثر الأمامية (germarium). (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء ولكن بثبات، وسحب سلسلة ovariole من غمد المبيض. الاستمرار في تشريح خارج ovarioles بشكل فردي حتى كل غرف البيض المرجوة هي صemoved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،7-1،8 لجميع المبيضين تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة كاملة، ونقل ovarioles إلى أنبوب 0.6ml باستخدام ماصة نقل البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح ovarioles تستقر في قاع الأنبوب، ثم الانتقال إلى تحديد وتلطيخ الخطوات. </li></ol> 2. مناعي (IF) تلون Ovarioles <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائل الإعلام من تشريح ovarioles مع ماصة. تأكد من عدم إزالة أي ovarioles أو غرف البيض. ترك ما يقرب من 50 ميكرولتر من ovarioles وسائل الإعلام تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهيد إلى 150 ميكرولتر من 0.1 M KPO 4 العازلة في أنبوب، وإضافة حل لغرف البيض لاصلاحها. احتضان بينما هزاز لمدة 10 دقيقة. تنبيه: بارافورمالدهيد هي سامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي، وشطف مرتين مع 0.5 مل غسل العازلة NP40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرجوع إلى معيار IF بروتوكول 15 لخطوات لاحقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، وبعد التثبيت، إضافةالأجسام المضادة الأولية في التخفيفات المناسبة واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل في NP40 عدة مرات، ثم يضاف الأجسام المضادة الثانوية (1: 200 التخفيفات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل عدة مرات في NP40، ثم إضافة دابي (1: 1،000) لمدة 10 دقيقة، ثم كرر يغسل. مرة واحدة IF البروتوكول هو كاملة، إضافة 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني لغرف البيض وترك الجلوس في RT لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل، يحل محله مع 70٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني، وتغطي مع احباط. وضع العينة في 4 ᵒC حتى جاهزة للتركيب. وفي الوقت نفسه، تواصل مع الخطوة 3. </li></ol></li></ol> 3. إعداد المسبق من الغليسرين جيلي الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس لا يقل عن 4 مل من الجليسرين جيلي باستخدام ملعقة وملء أنبوب ثقافة الخلية الزجاج إلى علامة منتصف الطريق. تذوب الجلسرين جيلي في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب قطرة صغيرة من الجلسرين، ما يقرب من 300 ميكرولتر من محلول المخزون على شريحتين المجهر. باستخدام الأنسجة، وتنتشر في الجلسرين رقيقة لاYER عبر كل الشرائح. هذا يوفر قاعدة ويسمح لسهولة إزالة من الجلسرين جيلي في خطوة 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الخروج من تصفيتها 1،000 ميكرولتر ماصة. استخدام قطع ماصة لنقل 1،000-1،500 ميكرولتر باب الحارة جيلي الجلسرين ببطء إلى كل شريحة المجهر. احرص على منع الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الشرائح الجلسرين جيلي الجلوس لمدة 5 دقائق على RT لتعيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل شريحة الجلسرين جيلي في 60 مم × 15 مم طبق بتري، وتغطي مع غلاف بلاستيكي. مكان في 4 درجات CO / N. اختياريا، متجر الجليسرين الشرائح جيلي لمدة تصل إلى 5 أيام في 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. تصاعد غرف البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عينات من الخطوة 2.5، ماصة عدة قطرات 3 ميكرولتر من غرف البيض في 70٪ الجلسرين عبر الجلسرين واحد جيلي الشريحة. مواصلة pipetting ل3 قطرات ميكرولتر حتى كل غرف البيض هي على هذه الشريحة. تأكد من كل قطرة يحتوي على الأقل عشرة غرف البيض. وفي الوقت نفسه، حرارة أنبوب ثقافة الجلسرين جيلي في 55 ° C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة الجلسرين جيلي مع الغرف البيض تحت المجهر تشريح. ضبط التكبير بحيث قطرة واحدة فقط من غرف البيض في مجال الرؤية (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة قياس 30 كما ملعقة، والتقاط غرفة مرحلة البيض المطلوب. عند الضرورة، منفصلة غرف البيض المرجوة من سلسلة ovariole باستخدام إبرة بمثابة سكين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب الحطام التي قد تتداخل مع التصوير، ونقل غرفة البيض إلى الشريحة الثانية الجلسرين هلام، ومع الأمامية التي تواجه اليسار (الشكل 1E -1). كرر حتى هناك اصطف لا يقل عن سبعة غرف البيض يصل في عمود (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل أعمدة جديدة من سبع حتى يتم نقل جميع غرف البيض المطلوب إلى الشريحة الثانية الجلسرين جيلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمزيق قطعة صغيرة من الأنسجة وتطور. استخدم هذا لامتصاص فائض PBS-الجلسرين من غرف البيض عن طريق لمس طفيفة كل واحد. الحرص على عدم إزالة غرف البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطعغيض من تصفيتها 200 ميكرولتر ماصة. استخدم هذا لنقل 150 ميكرولتر من الجلسرين جيلي لتغطية كافة الأعمدة من غرف البيض. ملاحظة: ويستند كمية من الجلسرين جيلي اللازمة لتغطية الأعمدة على البيض مراحل الغرفة وعدد من الأعمدة. ويمكن تعديل المبلغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح غرف البيض شنت الجلوس لمدة 5 دقائق على RT حتى الطبقة العليا من الجلسرين جيلي وطدت تماما (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشريحة من غرف البيض شنت في 60 مم × 15 مم طبق بتري، وتغطي مع غلاف بلاستيكي. تخزينها في 4 درجات CO / N للسماح للطبقات الجلسرين جيلي ليصلب معا (مكان في الظلام إذا كان هناك قلق حول photobleaching من). </li></ol> 5. إعداد غرف البيض للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة من غرف البيض شنت تحت المجهر تشريح. ضبط التكبير بحيث عمود واحد فقط من غرف البيض في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط مصغرة بزاوية 45 درجة، وقطع straigخط حزب التحرير على طول الجانب الأيمن من العمود الأول من غرف البيض (وثيقة إلى الجانب الخلفي من غرف البيض). (الشكل 1D-E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، وقطع فوق أول غرفة البيض في أعلى وأسفل مشاركة الغرفة البيض في العمود. عند هذه النقطة يجب أن تقطع العمود الغرف البيض من ثلاث جهات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام microknife، شريحة على طول الجانب الأيسر من العمود، في أقرب وقت ممكن إلى الجانب الأمامي من غرف البيض (الشكل 1E -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من البرد 1X PBT على عمود قطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة فوز جولة لإزالة هلام الجلسرين الزائدة حول ثلاثة جوانب من العمود قطع من غرف البيض وتجاهل، وترك الباقي على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف ملعقة في خفض التي قدمت في الجانب الأمامي من غرف البيض وفصل عمود من كتلة الجلسرين جيلي الابتدائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العينات إما مقلوب (5.8.1) أو تستقيم (5.8.2) المجهري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمقلوب المجهر: نقل Tانه عمود من غرف البيض إلى ساترة مع الجانب الأمامي من غرف البيض أسفل. كرر الخطوات من 5،2-5،8 حتى يتم إزالة كافة الأعمدة من الجلسرين معقود الفواكه وتحميلها. إضافة بضع قطرات من 50٪ PBS-الجلسرين على كل كتلة من غرف البيض لمنعهم من الجفاف. غرف الصورة البيض مباشرة على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمجهر تستقيم: نقل عمود من غرف البيض إلى شريحة المجهر مع الجانب الأمامي مواجهة. كرر الخطوات من 5،2-5،9 حتى يتم إزالة كافة الأعمدة من الجلسرين معقود الفواكه والتي شنت على شرائح المجهر. إضافة بضع قطرات من 50٪ PBS-الجلسرين على كل كتلة من غرف البيض وكتل غطاء مع # 1 ½ ساترة. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68 (1), 207-217 (2014).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila oogenesis.</a> Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+follicle+cells%3A+morphogenesis+in+an+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell.</a> Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).</li>
<li>Bilder, D., Haigo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+morphogenetic+repertoire%3A+perspectives+from+the+Drosophila+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg.</a> Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).</li>
<li>Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+choreography%3A+mechanisms+orchestrating+the+collective+movement+of+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).</li>
<li>Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border-cell+migration%3A+the+race+is+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Border-cell migration: the race is on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).</li>
<li>Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+JAK%2FSTAT+signaling+throughout+border+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila.</a> Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).</li>
<li>Ghiglione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cytokine+receptor+Domeless+controls+border+cell+migration+and+epithelial+polarization+during+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis.</a> Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).</li>
<li>Denef, N., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning%3A+JAK-STAT+signalling+in+the+Drosophila+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium.</a> Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).</li>
<li>Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK%2FSTAT+pathway+is+required+for+border+cell+migration+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis.</a> Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).</li>
<li>Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((slow+border+cells%2C+a+locus+required+for+a+developmentally+regulated+cell+migration+during+oogenesis%2C+encodes+Drosophila+C%2FEBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP.</a> Cell. 71 (1), 51-62 (1992).</li>
<li>Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gradient+of+JAK+pathway+activity+patterns+the+anterior-posterior+axis+of+the+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium.</a> Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+EGFR+ligands+participate+in+guiding+migrating+border+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells.</a> Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).</li>
<li>Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+localisation+of+cytokine+mRNA+is+essential+for+JAK%2FSTAT+activation+during+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness.</a> Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans+regulate+JAK%2FSTAT+signaling+and+distribution+of+the+Unpaired+morphogen%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen.</a> Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).</li>
<li>Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+protein+movement+in+syncytial+Drosophila+follicle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).</li>
<li>Rørth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+gain-of-function+genetics+in+Drosophila%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Systematic gain-of-function genetics in Drosophila).</a> Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+response+of+protein+localization+and+microtubule+organization+to+nutrient+stress+during+Drosophila+early+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis.</a> Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).</li>
<li>Quiñones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).</li>
<li>Belu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upright+imaging+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Upright imaging of Drosophila embryos.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).</li>
</ol>

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

نحن هنا تصف طريقة لتركيب وصورة صغيرة، وتطوير غرف البيض من منظور نهاية جرا. يتم تحسين أساليب مشتركة لغرف البيض التصوير وجهات النظر الجانبية وتسمح في المقام الأول التصور الدقيق للخلايا بصيلات ميديو الاطراف عندما ملطخة الأجسام المضادة الفلورسنت. استخدام Z-مداخن أو 3-D إعادة البناء يساعد في عرض طائرات التنسيق متعددة، ولكن لا يزال غير كاف لقرار الفرعية الخلوي للأقطاب الدوائر البيض بيضاوي الشكل (الشكل 2D). في حين أن هذا يمكن التغلب عليها جزئيا مع أحدث تقنيات الفحص المجه...

وقد وفرت دراسة ذبابة الفاكهة البطن رؤى كبيرة في التنظيم الجيني للمجموعة واسعة من الظواهر. على وجه الخصوص، لم يكن هناك بحوث واسعة النطاق على التنمية البيض، لأن مراحل تكوين البويضات يوفر طريقة الانقياد للتحقيق في العديد من العمليات التنموية المختلفة، بما في ذلك الزخرفة الأنسجة، والتغيرات قطبية الخلية، دورة الخلية التبديل، وتنظيم متعدية 1،2،3،4. حدث واحد morphogenic المهم خلال مراحل تكوين البويضات هي مواصفات، اكتساب القدرة على الحركة، والهجرة من مجموعة من الخلايا تسمى خلايا الحدود (استعراضها في 5). منذ الهجرة الخلية هو سمة أساسية من سمات التشكل الحيوان، ولأن التنظيم الجيني لهذه العملية يتم حفظها جيدا، وآليات تحدد في الذباب من المحتمل أن تكون مهمة في سياقات أخرى. وبالتالي، نحن نحقق في السيطرة الجزيئية للهجرة الخلايا الحدود. لدراساتنا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لمراقبة القطبين الأمامية تطوير البيض،حيث تنشأ خلايا الحدود، لدراسة كيفية تطوير بالتفصيل. داخل المبيض، وتوجد غرف البيض في مراحل النمو المختلفة على امتداد سلاسل دعا ovarioles، والتي المغطى في غمد رقيقة (الشكل 1A). وسيكون لكل غرفة البيض على المضي قدما لتشكيل بيضة واحدة. خلال مراحل تكوين البويضات، يجب عدة أنواع مختلفة من الخلايا تتطور بطريقة منسقة. وD. وتتكون غرفة البطن البيض من 16 خلايا خط الجرثومية، بما في ذلك بويضة واحدة، وتحيط بها طبقة واحدة ظهارة مسامي 6. تنشأ هناك عدد صغير من الخلايا المتخصصة، تسمى خلايا القطبية، في الأمامي والخلفي أقطاب ظهارة. الخلايا الحدود 6-8 تنشأ في الظهارة الأمامية للغرفة البيض، والناجمة عن الخلايا القطبية 5،7. في منتصف مراحل تكوين البويضات (المرحلة 9)، والخلايا الحدود فصل من جيرانهم وتهاجر بين الخلايا الممرضة للوصول إلى البويضة في الخلفي من الغرفة البيض 5،7. يجب إنجاز هذه الحركةبينما تبقى الخلايا الحدود في كتلة المحيطة خليتين القطبية غير متحركة، مما يجعل هذا النوع من الهجرة الخلية الجماعية. الهجرة الناجحة من الكتلة خلية الحدود يضمن التنمية السليمة للبويب من قشرة البيضة، وهو أمر ضروري للإخصاب. الخلايا القطبية الأمامية إرشاد مصير خلية الحدود من خلال تفعيل شلال نقل الإشارة. الخلية القطبية تفرز السيتوكينات، المفردة (UPD)، التي تربط لمستقبلات عبر الغشاء، Domeless (القبة)، وعلى خلايا بصيلات المجاورة خلال المرحلة 8 من تطوير بويضة 8،9. ربط UPD يسبب يانوس التيروزين كيناز (JAK) إلى الفوسفات ومحول الإشارات والمنشط من النسخ (STAT) 8،10،11. STAT ثم ينتقل إلى النواة لتفعيل النسخ. خلايا الحدود بطيئة (SLBO) هو عامل النسخ هذا هو الهدف النسخي المباشر للSTAT ومطلوب أيضا للهجرة الخلايا الحدود 12. إطلالة جانبية على غرف بيضة تشير روينظم قبعة النشاط STAT في التدرج عبر الظهارة الأمامية 8،11،13. خلايا بصيلات الأقرب إلى الخلايا القطبية وتحتوي على أعلى مستويات تنشيط STAT، وبالتالي فإنها تصبح خلايا الحدود وتغزو الأنسجة خط الجرثومية المجاورة. أن نفهم كيف يتم تحديد الخلايا الحدود داخل وفصل من ظهارة، نحن بحاجة لمراقبة كيفية تنظيم الأنسجة. وإذا نظرنا إلى غرف البيض من منظور الأمامي على ذلك، فإننا نتوقع التماثل شعاعي من النشاط STAT في خلايا بصيلات المحيطة الخلايا القطبية. ومن شأن نهاية على وجهة نظر أيضا تظهر بشكل أكثر دقة الاختلافات في بروتينات الغشاء واجهات خلية خلية قبل وأثناء مفرزة من مقارنة الخلايا في طائرات التنسيق المختلفة. لأن غرف البيض هي مستطيل وتعلق على بعضها البعض من خلال خلايا ساق، يحلون على الشرائح أفقيا، مما يجعل من الصعب مراقبة العمارة الأمامية. وبالتالي، الكثير من المعلومات عن الخلايا في القطبين من الغرفة بيضة لهاتم استنتاجها من وجهات نظر الاطراف. ورغم أن بعض المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال حسابي اعادة البناء 3-D من المقاطع البصرية، تشتت الضوء، photobleaching من، وحدود الفقيرة القرار في محور Z جعل هذه المعلومات أقل تفصيلا ويمكن الاعتماد عليها في غياب تقنيات باهظة الثمن مثل فائقة قرار المجهري 14 . أنواع أخرى من التصوير القائم على القسم (على سبيل المثال، المجهر الإلكتروني أو مشراح باجتزاء) تتطلب التلاعب واسعة من الأنسجة، بما في ذلك الجفاف، مما يزيد من احتمال عن القطع الأثرية. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لصورة D. غرف البطن البيض في حين تستقيم. هذه الطريقة أثبتت بالفعل مفيدة في توضيح كيفية الحظ خلايا متحركة (انظر ممثل النتائج ومانينغ وآخرون، قيد الاستعراض)، ومن المرجح أن يكون أكثر قيمة على نطاق واسع في الدراسات لجوانب أخرى من مراحل تكوين البويضات.

<table><tbody><tr><td>0.1 M عازلة فوسفات البوتاسيوم (KPO4 Buffer)</td><td></td><td></td><td>أضف 3.1 جم من NaH2PO4&bull; H2O و 10.9 جم من Na2HPO4 (اللامائية) إلى H2O المقطر لتكوين حجم 1 لتر. سيكون الرقم الهيدروجيني للمحلول النهائي 7.4. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية.</td></tr><tr><td>محلول مائي 16٪ بارافورمالدهايد ،</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td> من الدرجة <td>EM 15710</td><td>خالية من الميثانول للحفاظ على مضان GFP</td></tr><tr><td>30G × 1/2 بوصة إبرة &nbsp ؛</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>شطبة منتظمة</td></tr><tr><td>الخميرة الجافة النشطة</td><td>جينيسي العلمية</td><td>62-103</td><td>لتسمين إناث الذباب</td></tr><tr><td>الأبقار مصل الألبومين</td><td>PAA-cell استزراع شركة</td><td>A15-701</td><td>المستخدمة في NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Fulps</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11295-10</td><td>سبيكة Dumostar ، طرف بيولوجي ؛ نصائح حادة ضرورية لتشريح</td></tr> <tr><td>المبيضDAPI (4 & prime ؛ ، 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 مجم / مل محلول مخزون &nbsp ؛ &nbsp;</td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنيني (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>يضاف إلى وسيط تشريح المكملات الغذائية (10٪) &nbsp;</td></tr><tr><td>أنبوب ثقافة الزجاج</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td>14 مل</td></tr> شرائح <tr><td>الاكتئاب الزجاجي VWR</td><td></td><td>470019-020</td><td>1.2 مم سميكة ، جيلي الجلسرين مزدوج التجويف</td></tr><tr><td>&nbsp ؛</td><td>علوم المجهري الإلكترون</td><td>17998-10</td><td>تصاعد وسائل الإعلام</td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>IBI العلمية</td><td></td><td>IB15760 70٪ في PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td> <td>(قابل للتبديل ل Nonidet P-40) &nbsp; تستخدم في NP40 Wash Buffer &nbsp ؛</td></tr><tr><td>Leica مجسم الفلورسنت &nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 مجهر متحد البؤر</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x / 0.55NA هدف جاف &nbsp;</td></tr>ملعقة <tr><td>صغيرة&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td> شريحة مجهر <td>من الفولاذ المقاوم</td></tr> للصدأ <tr><td></td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 مم</td></tr><tr><td>NP40 Wash Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM TRIS-HCl ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ إيبيجال ، 1 مجم / مل BSA ، و 0.02٪ أزيد الصوديوم</td></tr><tr><td>بنسلين - ستربتومايسين - جلوتامين</td><td>لايف تكنولوجيز</td><td>10378-016</td><td>يضاف إلى وسط تشريح المكملات الغذائية (0.6X)</td></tr> <tr><td>Petridish- البوليسترين ، معقم</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 واط × 15 ارتفاع مم</td></tr><tr><td>عازلة الفوسفات الملحية</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>10 عبوات من مسحوق</td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>المستخدمة في 0.1 M KPO4 Buffer &nbsp;</td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>المستخدمة في 0.1 M KPO4 Buffer &nbsp;</td></tr><tr><td colspan = "4" >[header]</td></tr> <tr><td>Schneider' s تقنيات الحشرات متوسطة</td><td>العمر</td> <td> 11720018</td><td>مع L-الجلوتامين وبيكربونات الصوديوم</td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>المستخدمة في تلطيخ الأجسام المضادة الفلورية</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>المستخدمة في NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70144</td><td>1 M TRIS-HCl ، درجة الحموضة 7.4</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image برنامج التحليل</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>لمعالجة مكدسات Z متحدة البؤر</td></tr></tbody></table>

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

ذبابة الفاكهة يعطي تكوين البويضات السياق المثالي لدراسة العمليات التنموية المتنوعة نظرا لأن المبيض بسيط نسبيا في الهندسة المعمارية ، ويتميز جيدا ، وقابل للتحليل الجيني. تتكون كل غرفة بويضة من خلايا الخط الجرثومي محاطة بطبقة ظهارية واحدة من خلايا البصيلات الجسدية. تخضع مجموعات فرعية من خلايا البصيلات للتمايز خلال مراحل محددة لتصبح عدة أنواع مختلفة من الخلايا. تسمح التقنيات القياسية في المقام الأول برؤية جانبية لغرف البويضات ، وبالتالي رؤية محدودة لتنظيم خلايا البصيلات وهويتها. يصف بروتوكول التصوير العمودي تقنية تركيب تتيح رؤية رأسية جديدة لغرف البويضات باستخدام مجهر متحد البؤر القياسي. يتم تركيب العينات أولا بين طبقتين من هلام الجلسرين في وضع جانبي (أفقي) على شريحة مجهر زجاجي. ثم يتم تقطيع الهلام مع غرف البيض المغلفة إلى كتل ، ونقله إلى غطاء ، وقلببه لوضع غرف البيض في وضع مستقيم. يمكن تصوير غرف البيض المثبتة إما على مجهر متحد البؤر المستقيم أو المقلوب. تتيح هذه التقنية دراسة مواصفات خلايا الجريب ، والتنظيم ، والعلامات الجزيئية ، وتطور البويضات بتفاصيل جديدة ومن منظور جديد.

يسمح طريقة التصوير تستقيم لنا أن نرى بشكل مباشر على تنظيم الخلايا في ظهارة مسامي الأمامية في مرحلة 8. علامة العامة للمصير الخلايا المسام، وغابت عيون (EYA) بروتين، وكذلك DNA علامة النووية دابي، وأظهر حتى التعبير عبر هذا المجال من الخلايا، وأثبتت أن جميع الخلايا يمكن أن ينظر إليه مع شدة تلطيخ مماثلة (الشكل 2B &quot;). البروتينات تنظم ردا على UPD خلوى، ومع ذلك، أظهر أنماط المتغيرة ومستويات التعبير. الخلية القطبية تطلق UPD apically قبل هذه المرحلة من تطور البويضة <sup...

تسمح طريقة التصوير المستقيم الموضحة في هذا البروتوكول بالتصور التفصيلي لأقطاب ذبابة الفاكهة السوداء النامية. يوفر هذا العرض النهائي منظورا جديدا لترتيبات وأشكال أنواع الخلايا المتعددة في الظهارة المسامية.

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين التصوير عالي الدقة لأقطاب غرف البيض في ذبابة الفاكهة (drosophila). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح المبيض وصبغه بالأجسام المضادة الفلورية. وتتمثل الخطوة الثانية في تحديد غرف البيض ذات الصلة وفصلها.يتم بعد ذلك توجيه العينات المختارة ومحاذاتها، ثم تثبيتها في قوالب من هلام الجلسرين. وتتمثل الخطوة النهائية في قطع القوالب وتدويرها لتثبيت حجرات البيض بحيث يكون المحور الطولي عموديًا. وفي النهاية، يُستخدم المجهر البؤري (confocal microscopy) للكشف عن التنظيم الخلوي ودون الخلوي عند أقطاب حجرة البيض.النسيج الطلائي، مثل ترتيبات الخلايا الحدودية، يمكن أن تتأثر بالطرق الحالية لمعاينة العينات بشكل عمودي على مستوى التصوير عبر القطع البصري وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد خوارزمياً، مما قد يتسبب في التبييض الضوئي وتشتت الضوء ويوفر دقة أقل، وهو ما يؤدي إلى صور أقل دقة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح لنا تثبيت العينات بزاوية جديدة ومعاينتها مباشرة. وقد استخدمنا هذه التقنية لتصوير أقطاب غرف البيض النامية، مما وفر رؤية معمقة حول تنظيم الخلايا الجريبية.يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم خطوات التحضير والتثبيت لأنها تتطلب معالجة دقيقة لعينات الصبغ وإعادة توجيه العينات بعيداً عن وجهات النظر التقليدية. ستقوم لثيا مانينغ، وهي طالبة دراسات عليا في مختبري، بتوضيح الإجراء. لبدء التجربة، أحضر شريحة زجاجية ذات تجويف وضع عدة قطرات من وسط التشريح في كل تجويف باستخدام الماصة.قم بتخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون وضعه تحت مجهر تشريحي. بعد ذلك، قم بتوجيه ذبابة أنثى واحدة بحيث تكون الأجنحة للأسفل والرأس باتجاه اليسار. أمسك الملاقط في كل يد بزاوية 30 درجة بالنسبة لسطح الطاولة باستخدام اليد غير المهيمنة.التقط الذبابة باستخدام الملقط. أمسك الذبابة من الطرف الأمامي للبطن بالقرب من الصدر واغمرها في وسط التشريح. ضعها في شريحة التجويد باستخدام الزوج الآخر من الملاقط.أمسك الهيكل الخارجي من الناحية البطنية الخلفية للبطن ثم ثقبه. أمسك المبيضين من الطرف الخلفي، ثم اسحبهما خارج البطن وضعهما في الوسط الجديد على الجانب الآخر من شريحة التثبيت (depression slide). بعد ذلك، ثبت مبيضاً من الطرف الخلفي بالقرب من أكبر غرف البيض، وباليد الأخرى، اضغط على إحدى غرف البيض الأكثر أمامية أو الحجيرة ببطء وثبات.اسحب سلسلة من البويضات من غمد المبيض واستمر في تشريح كل بويضة على حدة حتى يتم إزالة جميع حجرات البيض المطلوبة. وبمجرد اكتمال التشريح، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل البويضات إلى أنبوب سعة 0.6 milliliter واترك البويضات تترسب في قاع الأنبوب. وباستخدام الماصة، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط التشريح من فوق البويضات بعناية.احرص على عدم إزالة أي غرف مبيضية أو غرف بيض عند النقل إلى أنبوب جديد. أضف 50 µL من البارافورمالدهيد بتركيز 16% إلى 150 µL من منظم فوسفات البوتاسيوم بتركيز 0.1 molar، ثم أضف هذا المزيج إلى غرف البيض. قم بحضنها مع التحريك لمدة 10 دقائق، وبعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة المثبت.اشطف العينات مرتين باستخدام منظم NP 40، ثم اغسلها فوق الحوامل مرتين بـ 0.5 milliliters من منظم NP 40 لمدة 15 دقيقة لكل غسلة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت والغسل، أضف الأجسام المضادة الأولية واحضن العينات طوال الليل في درجة حرارة أربع درجات مئوية أو لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الحضن، اغسل العينات أربع مرات لمدة 20 دقيقة لكل غسلة بـ 0.5 milliliters من منظم NP 40 في درجة حرارة الغرفة.ثم أضف الأجسام المضادة الثانوية بتخفيف 1 إلى 200 واحضن الأنبوب لمدة ثلاث ساعات أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، أضف DPI بتخفيف 1 إلى 1000 واحضن الأنبوب لمدة 10 دقائق. ثم اغسل العينات أربع مرات باستخدام 0.5 mL من محلول غسيل NP 40 لمدة 20 دقيقة لكل غسلة في درجة حرارة الغرفة.بمجرد اكتمال بروتوكول التألق المناعي (IF)، أضف 200 µL من الجلسرين بتركيز 50% في PBS إلى غرف البيض واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين مع حمايتها من الضوء. قم بإزالة المحلول، ثم استبدله بالجلسرين بتركيز 70% في PBS وغطِّ الأنبوب بورق القصدير. تُحفظ العينات عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت تثبيتها.لتحضير شريحة هلام الجلسرين، يتم نقل كمية من هلام الجلسرين باستخدام ملعقة (spatula) لملء أنبوب زراعة زجاجي من نوع Pyrex سعة 15 milliliter إلى منتصفه تقريبًا، ثم يُذاب هلام الجلسرين في حمام مائي عند درجة حرارة 55 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة. وفي هذه الأثناء، يتم وضع قطرة بحجم 300 microliter من الجلسرول من المحلول المخزون على شريحتين مجهريتين. وباستخدام منديل ورقي، يُوزع الجلسرول في طبقة رقيقة على كل من الشريحتين.لتوفير قاعدة تسمح بإزالة هلام الجلسرين بسهولة. تحقق من ذوبان هلام الجلسرين تماماً. بعد ذلك، اقطع طرف رأس ماصة 1000 ميكرولتر ذات مرشح، وانقل من 1000 إلى 1,500 ميكرولتر من هلام الجلسرين الدافئ ببطء إلى كل شريحة مجهرية، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات.اترك شرائح جيلي الجلسرين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ليتماسك كل جيلي جلسرين. ضع الشرائح في طبق بتري مقاس 60 مليمتر في 15 مليمتر. غطِّ الطبق بغلاف بلاستيكي واحفظ الشرائح عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.باستخدام الماصة، ضع عدة قطرات بحجم 3 µL من غرف البيض من العينات التي تم تحضيرها مسبقاً في 70% glycerol موزعةً على شريحة هلام الجلسرين الواحدة. استمر في سحب قطرات بحجم 3 µL حتى يتم نقل جميع غرف البيض إلى الشريحة، مع التأكد من أن كل قطرة تحتوي على 10 غرف بيض على الأقل. بعد ذلك، قم بتسخين أنبوب زراعة يحتوي على هلام الجلسرين في حمام مائي عند درجة حرارة 55 °C، ثم ضع شريحة هلام الجلسرين التي تحتوي على غرف البيض تحت مجهر تشريحي واضبط قوة التكبير بحيث تظهر قطرة واحدة فقط من غرف البيض في مجال الرؤية.باستخدام إبرة قياس 30 كملعقة، التقط حجرة البيضة في المرحلة المطلوبة عند الضرورة. افصل حجرات البيض المطلوبة من سلسلة المبيض باستخدام الإبرة كسكين لتجنب وجود الشوائب التي قد تعيق عملية التصوير. انقل حجرة البيضة إلى شريحة هلام الجلسرين الثانية.كرر هذه الخطوة حتى يتم اصطفاف سبع حجرات بيض على الأقل في عمود واحد بحيث تكون الجوانب الأمامية متجهة نحو اليسار. استخدم الإبرة لكشط الحطام أو حجرات البيض غير المرغوب فيها لتشكيل أعمدة جديدة مكونة من سبع حجرات حتى يتم نقل جميع حجرات البيض المطلوبة إلى شريحة هلام الجلسرين الثانية. قم بلف قطعة صغيرة من منديل كيم (Kim wipe)، ثم امتص فائض محلول PBS glycerol من حجرات البيض عن طريق لمس كل واحدة منها بخفة. احرص على عدم إزالة أي من حجرات البيض.اقطع طرف رأس ماصة 200 microliter المخصصة للترشيح وانقل 150 microliters من هلام الجلسرين لتغطية جميع أعمدة حجرات البيض. تحقق تحت المجهر من تغطية جميع أعمدة حجرات البيض. اترك حجرات البيض المثبتة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى تتصلب الطبقة العلوية من هلام الجلسرين تماماً.بعد ذلك، ضع شريحة من غرف البيض المثبتة في طبق بتري مقاس 60 مليمتر في 15 مليمتر وقم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي. احفظ الطبق في درجة حرارة 4 °C طوال الليل للسماح لطبقات هلام الجلسرين بالتصلب معاً في الظلام. وإذا كان من المحتمل حدوث تبييض ضوئي، ضع شريحة غرف البيض المثبتة تحت مجهر تشريحي.اضبط قوة التكبير بحيث يظهر عمود واحد فقط من غرف البويضات في مجال الرؤية. وباستخدام مشرط صغير بزاوية 45 درجة، قم بقص خط مستقيم على طول الجانب الأيمن من العمود الأول من غرف البويضات بالقرب من الجانب الخلفي لغرف البويضات.بعد ذلك، قم بالقص فوق أول غرفة بيض في الأعلى وأسفل آخر غرفة بيض في العمود بحيث تصبح غرف البيض مقصوصة من ثلاث جهات. استخدم سكيناً دقيقاً (micro knife) للقطع على طول الجانب الأيسر للعمود بأقرب نقطة ممكنة من الجانب الأمامي لغرف البيض. ثم قم بنقل 100 µL من XPBT البارد فوق العمود المقطوع باستخدام الماصة والملعقة.قم بإزالة هلام الجلسرين الزائد من الجوانب الثلاثة للعمود المقطوع من غرف البيض وتخلص من الكمية الزائدة. أدخل الملعقة المسطحة (spatula) في القطع الذي تم إجراؤه في الجانب الأمامي لغرف البيض وافصل العمود عن كتلة هلام الجلسرين الأساسية لتثبيته على شريحة والبدء في التصوير. تتيح طريقة التصوير الرأسية رؤية مباشرة لتنظيم الخلايا في الظهارة الجريبية الأمامية في المرحلة الثامنة.يُظهر واسم عام لسلفات الجريب، وبروتين eyes absent أو IA، بالإضافة إلى واسم الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين النووي DPI، تعبيراً متساوياً عبر هذا المجال من الخلايا، ويوضح أن جميع الخلايا يمكن رؤيتها بكثافات صبغية مماثلة. وتتباين الرؤية التقليدية لغرفة البيضة مع الرؤية الناتجة عن إعادة البناء ثلاثي الأبعاد لغرفة البيضة. ويوضح الشكل المدرج المحور الذي تم تدويره.المحور x يتجه للأسفل. والمحور Z يتجه الآن نحو اليسار، بينما يتجه المحور Y نحو المشاهد. تظهر الخلايا الفردية مشوشة بسبب انخفاض الدقة في المحور Z.وبالتالي، يمثل النهج الجديد تحسناً ملحوظاً في التصوير. حيث تتيح طريقة التصوير الرأسي تصور الظهارة الأمامية في غرف البيض في المرحلة التاسعة بشكل فعال. وفي هذه المرحلة التنموية، تندمج الخلايا الحدودية معاً حول الخلايا القطبية.تُلاحظ هذه التكتلات المتراصة باستخدام تصوير endon. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثبيت العينات للسماح بمنظورات رؤية جديدة. لقد استخدمنا هذه التقنية لتصوير أقطاب غرف البيض النامية في مراحل مختارة.يمكن استخدام هذه التقنية العامة لمراحل أخرى من ذبابة الدروسوفيلا (drosophila)، أو لعملية تكوين البويضات، أو لأنواع أخرى من الأنسجة الصغيرة.

upright-imaging-of-drosophila-egg-chambers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

جرحشاعثزرحشرتاد مضان التصوير المقطعي يعمل خارج حدود اختراق الأنسجة sectioning المجهري مضان. وتستند هذه التقنية على التعددية إسقاط الإضاءة والنقل وصفا الفوتون. علينا أن نظهر في الجسم الحي ، كامل الجسم التصور 3D من التشكل من GFP - معربا عن أقراص تخيلي في...

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

hemocytes ذبابة الفاكهة تفريق أكثر من مجمل الجنين النامية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تحميل الصور وهذه الهجرات استخدام الاجنة مع hemocytes fluorescently المسمى.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

هنا نطرح على بروتوكول لتصاعد...

تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة

تلوين الأجسام المضادة...

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Immunostaining هي تقنية فعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا والبروتينات داخل الأنسجة. من خلال استخدام الصوتنة ، يخفف البروتوكول الموصوف هنا من الحاجة إلى تشريح أنسجة ذبابة الفاكهة السوداء من الأجنة واليرقات في المرحلة المتأخرة قبل تلطيخ المناعة. نحن نقدم منهجية فعالة للتلوين المناعي لليرقات الكاملة المثبتة بالفورمالديهايد.

-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة<em&gt; في الموقع</em

يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة لتصوير ذبابة الفاكهة الظهارية العصبية الحية للعين العذراء. تعوض هذه الطريقة عن حركة الأنسجة والطوبولوجيا غير المتكافئة ، وتعزز تصور حدود الخلية من خلال استخدام العديد من بروتينات التوصيل الموسومة ب GFP ، وتستخدم جهاز تصوير سهل التجميع.

يعيش التصوير لل ذبابة الفاكهة العذراء العين

توضح هذه المقالة بروتوكول تكيف خارج الحي لتصور كا 2+ خلال تفعيل البيض في ذبابة الفاكهة.

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

تم تصميم هذا البروتوكول لتصوير وتحليل ديناميات اتجاه الخلية ونمو الأنسجة في ظهارة البطن Drosophila كما ذبابة الفاكهة يخضع التحول. يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة هنا على دراسة مختلف مراحل النمو والأنسجة والهياكل تحت الخلوية في دروسوفيلا أو غيرها من الكائنات النموذجية.

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإجراء تصوير مباشر للانقسام غير المتماثل للخلايا الجذعية الجرثومية (GSCs) في ذبابة الفاكهة في مكانة المبيض. نستخدم خطا معدلا وراثيا يعبر في كل مكان عن اندماج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لبروتين الطيف Par-1.

التصوير الحي الممتد لمنافذ الخلايا الجذعية الجرثومية ذبابة الفاكهة السوداء

اكتشف طريقة التصوير العمودي لغرف بيض ذبابة الفاكهة باستخدام المجهر الضوئي المجهري. تُظهر هذه التقنية التنظيم الخلوي والتحت خلوي للأقطاب بوضوح عالٍ.

التصوير تستقيم من

استكشف المزيد من الفيديوهات