خط أنابيب سريعة وموثوق بها للدراسة وتحليل الحالات البكتيرية Transcriptome على: تنظيم الجينات سيرين التي تعتمد في العقدية الرئوية
أبريل 25, 2015
تصف هذه المخطوطة استخدام أحدث التقنيات التي توفرها المصفوفات الدقيقة للحمض النووي. توفر المصفوفات الدقيقة نظرة عامة على التغيرات النسخية في البكتيريا التي تحدث في ظل ظروف معينة. علاوة على ذلك ، نسلط الضوء على السهولة التي يمكن من خلالها تحليل كميات كبيرة من البيانات باستخدام حزم برامج ملائمة تم تطويرها داخليا.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم نظرة عامة على التغيرات النسخية في البكتيريا التي تحدث في ظل حالة معينة. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا البكتيرية وحصادها أولا في ظل ظروف معينة. بعد ذلك ، يتم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا المحصودة ويتم صنع CDNA من الحمض النووي
الريبي.ثم يتم تصنيف CDNAs وتهجينها إلى شرائح فحص دقيقة داخلية. أخيرا ، يتم غسل الشريحة وبعد ذلك يتم مسح الشرائح وتحليلها. في النهاية ، يتم استخدام المصفوفة الدقيقة لإظهار التغيرات النسخية في الخلايا البكتيرية في ظل الحالة المحددة.
الميزة الرئيسية لتقنية المصفوفات الدقيقة للحمض النووي على الطرق الأخرى الموجودة لدراسة التعبير الجيني مثل QPCR أو النشاف الشمالي ، هي أنها توفر نظرة عامة عالمية على جميع التغييرات النسخية التي حدثت في ظل ظروف معينة. إنه سريع وموثوق ورخيص نسبيا. سيتم توضيح الإجراء محمد سال وإيرون مانزو ، طلاب PSD من مختبري في علم الوراثة الجزيئية بعد الذوبان ، s pmo ، حبيبات خلية ED 39 و Resus معلقة في 400 ميكرولتر من te وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد ما يلي في أنابيب الغطاء اللولبي الحر من الحمض النووي الريبي ، 0.5 جرام من الخرز الزجاجي ، 50 ميكرولتر من 10٪ SDS 500 ميكرولتر من كلوروفورم الفينول المحضر مسبقا وكريات الخلية المعلقة.
لكسر الخلايا ، ضع الأنابيب في مضرب حبة وتجانس مرتين لمدة 60 ثانية كل منها على الجليد لمدة دقيقة واحدة بين النبضات ، ثم طرد العينات عند 10،000 جي وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. انقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد ، وعند 500 ميكرولتر من الكلوروفورم i a ، a وجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق إضافية. ماصة 500 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى الأنابيب الجديدة.
أضف مجلدين من المخزن المؤقت لربط التحلل واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي ، قم بعزل الحمض النووي الريبي الكلي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة لإزالة الحمض النووي الملوث من الحمض النووي الريبي. أضف 100 ميكرولتر من مزيج D a واحتضانه عند 15 إلى 25 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
استخدم مجموعة RN a لغسل الحمض النووي الريبي النظيف و Elute بحجم 50 ميكرولتر لتنفيذ تفاعل الركوع في أنابيب PCR سعة 300 ميكرولتر. امزج إجمالي الحمض النووي الريبي مع ميكرولترين من المونومرات العشوائية واستخدم الماء الخالي من النوكلياز إذا لزم الأمر لرفع الحجم إلى 18 ميكرولترا. احتضان خليط الركوع على حرارة 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم قم بتبريد التفاعلات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وقم بتدويرها بسرعة قبل وضع الأنابيب على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل. لعكس نسخ CDNA ، قم بإعداد مزيج النسخ العكسي ، وامزج 18 ميكرولترا من المزيج مع 12 ميكرولترا من المزيج الرئيسي واحتضان التفاعل عند 42 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى 16 ساعة. قم بتحلل الرنا المرسال من التفاعل بإضافة ثلاثة ميكرولترات من 2.5 مولر و OH وضعه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا.
ثم أضف 15 ميكرولترا من أكوام مولارية خالية من الحمض لتحييد NAOH. ثم بعد استخدام أعمدة تنظيف PCR لتنقية CDNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس تركيز CDNA لتسمية CDNA. أضف خمسة ميكرولترات من متوسط الصبغة التفاعلية إلى 20 إلى 60 نانوجراما لكل ميكرولتر من CDNA.
ضع الخليط في درجة حرارة الغرفة المظلمة والمحتضنة لمدة 60 إلى 90 دقيقة قبل استخدام أعمدة تنظيف العلاقات العامة لتنقية الصبغة المسماة CDNA التي تراوغ في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتطور باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، وتأكد من أن تركيز CDNA المسمى لا يقل عن 0.5 مول بيكو لكل ميكرولتر في حجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولترا. بعد تحضير المخزن المؤقت الخجول ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتسخين المخزن المؤقت مسبقا عند 68 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. لتحضير العينة ، اجمع بين كميات متساوية من CDNAs المسمى ، ثم استخدم مكثفات الفراغ عند درجة حرارة عالية لتقليل الحجم إلى سبعة ميكرولتر أو أقل.
في غضون ذلك ، لتنظيف زلات الرافع لتقليل إشارة الخلفية ، استخدم الصابون والكثير من ماء الصنبور ، متبوعا بالإيثانول بنسبة 100٪ بعد تجفيف زلات الرافع ، ضع واحدة على شريحة مع توجيه بطانة التفلون البيضاء لأسفل. بعد ذلك ، قم بإذابة عينات الصبغة المجففة في سبعة ميكرولترات من H2O واحتضانها عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين. أضف على الفور 35 ميكرولترا من المخزن المؤقت الخجول المسخن مسبقا ، واخلطه برفق وقم بالدوران والسرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة.
لرواسب الحبيبات ، قم بتسخين المسبار عند 68 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا قبل التحميل. لتجميع شريحة الشريحة والرافع ، ضع حامل شريحة التهجين على كتلة حرارية عند 50 درجة مئوية. ضع شرائح المصفوفة الدقيقة للحمض النووي مع انزلاق الرافع على حامل شريحة التهجين الساخن وقم بتسخين الشريحة مسبقا مع زلة الرافع لمدة دقيقة.
ثم ، في أسرع وقت ممكن ، أضف 40 ميكرولترا من العينة المستهدفة إلى نهاية الشريحة. اسمح للسائل بالتدفق بين الأسطح الزجاجية بقوة الشعيرات الدموية. الآن قم بإزالة كاسيت التهجين الدافئ من فرن التهجين وأغلق الجهاز.
ثم ضع ورق الترشيح المنقوع بثلاثة ملليلتر من اثنين من XSSC في علبة التهجين. ضع حامل شريحة التهجين برفق مع الشرائح في كاسيت التهجين. أغلق كاسيت التهجين وضعه مرة أخرى في فرن التهجين واحتضنه لمدة 16 إلى 18 ساعة.
لغسل الشرائح ، قم بإعداد مخازن غسيل طازجة واحدة واثنتين وثلاثة ، وضعها على حرارة 30 درجة مئوية. لضمان ذوبان SDS عند اكتمال الحضانة ، قم بغمر الشرائح برفق في أسرع وقت ممكن في أنبوب فالكون مملوء ب 50 مل من محلول الغسيل ، واحد حتى يستقر الزجاج في قاع الأنبوب. بعد أن ينزلق الرافع ، يغرق في أسفل الأنبوب دون خدش المصفوفة ، استخدم الملقط لإزالة الشريحة ووضعها في رف محطة الغسيل.
استخدم على الفور 500 مل من مخزن الغسيل لغسل الشرائح لمدة خمس دقائق. ثم انقل الشرائح لغسل المخزن المؤقت لمدة 20 إلى 30 دقيقة قبل نقلها إلى 500 مل من مخزن الغسيل الثالث لمدة خمس دقائق. أخيرا ، جفف الشرائح عند 2000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين قبل إجراء تحليل المصفوفات الدقيقة.
وفقا لبروتوكول النص لدراسة تأثير L serin على النسخ الكامل للالتهاب الرئوي S ، تم إجراء تحليل المصفوفات الدقيقة لسلالة D 39 Wildtype لسلالة D 39 المزروعة في آلية التنمية النظيفة مع 150 ميكرومولار من L Seine ، مقارنة بتلك المزروعة في 10 ملليمولار لتر من السين في نفس الوسط. يسرد هذا الجدول تركيزات الحمض النووي الريبي الكلي المعزولة من كل مزرعة كما هو موضح في هذا الشكل. بعد إزالة الحمض النووي ، تم فحص جودة الحمض النووي الريبي.
يمثل هذان المساران الحمض النووي الريبي من 150 ميكرومولار من السين ، وهذان المساران من الثقافات المزروعة ب 10 مللي مولار من الشباك. يشير وجود شريطين واضحين إلى نوعية جيدة من الحمض النووي الريبي. يتم تسجيل تركيزات CDNA المركبة من إجمالي الحمض النووي الريبي في هذا العمود ويتم سرد عينات الصبغة التفاعلية المتوسطة AM هنا.
يظهر تحليل مخطط مبعثر لمتوسط نسبة القوالب التفاعلية AM في هذا الشكل ، وتم تحليل البيانات بشكل أكبر لتقليل الضوضاء. يلخص هذا الجدول نتائج دراسات المصفوفات الدقيقة بعد تطبيق معايير الفرق الأكبر من أو يساوي الفرق المزدوج وقيمة P أقل من 0.001. كما هو موضح هنا ، تم التعبير عن عدد من الجينات بشكل تفاضلي في وجود الحد الأدنى من L serin مقارنة بالحد الأقصى بعد هذا الإجراء.
يمكن استخدام طرق أخرى مثل البيج ، والخلايا الكهربائية ، ومقايسات QPCR ، والضربة القاضية ، و / أو قوة التعبير من أجل الإجابة على الأسئلة القادمة بعد تطويرها. أعطت هذه التقنية باحثي VFR في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية لاستكشاف الشبكات والآليات التنظيمية في ذاكرة الوصول العشوائي الإيجابية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المخطوطة استخدام أحدث التقنيات التي توفرها المصفوفات الدقيقة للحمض النووي لتحليل التغييرات في النسخ الجيني في البكتيريا. يتضمن العملية زراعة الخلايا البكتيرية في ظروف معينة، وعزل الحمض النووي الريبي الكلي، واستخدام برامج مطورة داخليًا لتحليل البيانات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- علم الجينوم
- علم المعلوماتية الحيوية
الخلفية
- المصفوفات الدقيقة للحمض النووي هي أدوات قوية لدراسة التعبير الجيني.
- تحليل النسخ الجيني يساعد في فهم استجابات البكتيريا للتغيرات البيئية.
- يمكن للبرامج الداخلية تسهيل تحليل مجموعات البيانات الكبيرة.
- تركز هذه الدراسة على حالة معينة تؤثر على الخلايا البكتيرية.
هدف الدراسة
- تقديم نظرة عامة على التغييرات في النسخ الجيني في البكتيريا.
- لإثبات فعالية المصفوفات الدقيقة للحمض النووي في تحليل التعبير الجيني.
- لتسليط الضوء على سهولة تحليل البيانات باستخدام البرامج المخصصة.
الطرق المستخدمة
- نمو وحصاد الخلايا البكتيرية في ظروف معينة.
- عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا المحصودة.
- تحويل الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي المكمّل.
- تصفية وتهجين الحمض النووي المكمّل إلى شرائح المصفوفات الدقيقة.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للحمض النووي الريبي وتحويله إلى الحمض النووي المكمّل.
- تهجين فعال للحمض النووي المكمّل إلى شرائح المصفوفات الدقيقة.
- كشف التحليل عن تغييرات نسخية جينية كبيرة.
- تم تبسيط تحليل البيانات باستخدام البرامج الداخلية.
الخلاصات
- المصفوفات الدقيقة للحمض النووي فعالة في دراسة النسخ الجيني البكتيري.
- تعزز البرامج المخصصة قدرات تحليل البيانات.
- يمكن تطبيق هذه المنهجية في دراسات بكتيرية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
DNA microarray technology enables rapid, cost-effective global transcriptome profiling in bacterial systems, supporting target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery. By capturing genome-wide transcriptional responses to environmental stimuli such as nutrient availability, the method provides predictive confidence in pathway modulation and gene regulatory networks. This facilitates early-stage hypothesis triage and portfolio prioritization in antibacterial R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to serine availability, clarifying gene regulatory networks in S. pneumoniae.
- Operational Value: Provides a standardized workflow from cell harvest to data analysis using optimized RNA isolation and labeling protocols.
- Predictive Value: Identifies differentially expressed genes with ≥2-fold change and p<0.001, supporting confidence in target modulation under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide expression profiles enabling comparison of transcriptional states across growth conditions.
- Operational Value: Utilizes homemade microarray slides and standardized hybridization/wash buffers to ensure reproducibility and low background signal.
- Scalability: Supports parallel processing of multiple samples via vacuum concentration and automated scanning for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro transcriptional responses to potential in vivo relevance by modeling nutrient stress conditions encountered during infection.
- Mechanistic De-risking: Clarifies serine-dependent gene regulation, reducing uncertainty in target essentiality and pathway inhibition strategies.
- Preclinical Alignment: Enables identification of co-regulated gene clusters that may represent druggable pathways or virulence modulators.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in target validation and informing lead identification through mechanistic insights into bacterial adaptation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by revealing condition-specific transcriptional reprogramming.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs suitable for assay readiness and cross-condition comparison in antimicrobial screening campaigns.
- Analytics: Employs Microprep for preprocessing and Cyber-T for statistical analysis, enabling robust identification of significant expression changes.
- Translational Research: Connects laboratory observations to pathogenic relevance by modeling host-associated metabolic pressures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across bacterial strains and growth conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies through unbiased, global expression profiling.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA quality checks, dye labeling thresholds, and slide washing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by highlighting condition-specific essential genes and regulatory hubs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, RNA handling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to microarray scanning equipment and spectrophotometric quantification tools.
- Necessitates cross-team standardization of RNA isolation, labeling efficiency, and data preprocessing workflows.
- Involves adaptation considerations when extending to Gram-negative or fastidious bacterial models.
- Limited by the requirement for prior sequence knowledge to design homemade microarray probes.
