جيل من الليمفاوي المجهرية الدقيقة وكشف لهم تأثير Proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الإنتاج في المختبر للجسيمات الدقيقة للخلايا الليمفاوية أو LMPs من خط خلايا الخلايا الليمفاوية التائية ، وإثبات تأثيرها المؤيد لموت الخلايا المبرمج على الخلايا الظهارية في مجرى الهواء. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنتاج LMPs أولا. بعد ذلك ، تتميز LMPs المعزولة بتحليل الفاكس.

ثم يتم استزراع مستخلصات أنسجة الشعب الهوائية. أخيرا ، يتم إجراء علاج LMP على مستخلصات الشعب الهوائية. في النهاية ، يتم استخدام الفحوصات النسيجية المرضية مثل الهيمات والتوين واليوزين واكتشاف موت الخليتين NC لإظهار تلف الطبقة الظهارية القصبية الناجم عن LMP وموت الخلايا المبرمج للخلايا الظهارية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل عزل الجسيمات الدقيقة عن الدم المحيطي البشري هي أننا قادرون على إجراء توليد واسع النطاق للجسيمات الدقيقة المشتقة من خط الخلية في المختبر. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الخطوات الحاسمة لثقافة القصبات الهوائية ليس من السهل التحضير. لبدء الثقافة.

خلايا CEMT في أربع قارورة T 1 75 تحتوي كل منها على 150 مل من الطازجة والمتوسطة وتحتضن عند 37 درجة مئوية بكثافة 2 مليون خلية لكل مليلتر. اجمع الخلايا من كل قارورة عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق ، وثني الريوس 300 مرة 10 إلى الخلايا الست في قارورة T 1 75 جديدة تحتوي على 150 مل من الوسط الطازج. للحفاظ على كثافة 2 مليون خلية لكل مليلتر ، أضف 37.5 ميكرولتر من الأكتين مايسين D إلى الوسط بتركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

انقل كل وسط الثقافة إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر ، وقم بتدوير الخلايا عند 750 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم انقل المادة الطافية إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر وأجهزة طرد مركزي بمعدل 1500 مرة G لمدة 15 دقيقة لإزالة شظايا الخلايا الكبيرة. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى زجاجة سعة 250 مليلتر وجهاز طرد مركزي فائق عند 12،000 مرة جم لمدة 50 دقيقة.

ثم تخلص من المادة الطافية واجمع الكريات. استخدم 40 مل من PBS المعقم لغسل الكريات المخصبة LMP في أنبوب 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 12,000 مرة G لمدة 50 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.

اجمع المادة الطافية من آخر غسلة لاستخدامها كعنصر تحكم في السيارة باستخدام مليلتر واحد من PBS. قم بتعليق الكريات ونقلها إلى أنبوب دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر وقم بتخزين LMPs المعزولة عند سالب 80 درجة مئوية. لتوصيف الجسيمات الدقيقة عن طريق تحليل الفاكس ، ابدأ بإعداد عينتين من محلول nexin ، واحدة مع كلوريد الكالسيوم والأخرى بدون الكالسيوم.

في أنبوب الفاكس ، قم بتخفيف ميكرولتر واحد من LMPs في 44 ميكرولترا من عازلة nexin مع كلوريد الكالسيوم. قم بإعداد أنبوب آخر باستخدام عازلة nexin بدون كلوريد الكالسيوم. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من X و V sci خمسة إلى كل أنبوب واخلطها جيدا في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، استخدم 400 ميكرولتر من سائل غمد الأنفلونزا بالفاكس. لإيقاف التفاعلات ، أضف 10 ميكرولتر من معلق حبات عد سبعة ميكرون كمعيار داخلي في كل أنبوب. للحصول على العد المطلق ، تم إنشاء بوابات ذات حجم نسبي ، و FSCH والحبيبات النسبية SSCH ومخطط النقطة على مقياس التدفق الخلوي.

باستخدام حبات الفلورسنت المعايرة بحجم ميكرومتر واحد للبوابة الأولى وعد الخرز عند سبعة ميكرومتر. بالنسبة للبوابة الثانية ، قم بتحليل عينة LMP على مخطط F-S-C-H-S-C-H باستخدام البوابات المحددة وقناة FL الرابعة لمخطط النقطة الملحقة عن طريق الحصول على إشارة حتى يتم الوصول إلى 10،000 حبة عد في المشية الثانية ، وتحديد الإيجابية في أحداث NV السابقة ل LMPs في عازلة nexin المحتوية على كلوريد الكالسيوم وطرح أحداث LMPs في مخزن nexin المؤقت بدون كلوريد الكالسيوم. احسب العدد المطلق ل LMPs بناء على المعادلة التالية.

يستخدم ملاقط دومون فائقة النعومة ومقص جراحي لتشريح أنسجة الرئة بشكل معقيم. قم بإزالة الحمة والأوعية الدموية بعناية. قم بتشريح الشعب الهوائية المغمورة في وسط غسل الأنسجة وفصل الشعب الهوائية التي يبلغ قطرها من واحد إلى 2.5 ملم عن أنسجة الرئة المحيطية.

استخدم مشرطا لتقطيع أنسجة الشعب الهوائية إلى صفوف الشعب الهوائية بسمك خمسة ملليمترات تقريبا باستخدام حركة مغرفة باستخدام ملقط التشريح الدقيق المنحني المعقم. التقط شظايا الشعب الهوائية وضعها على المناطق المخدوشة من الأطباق المعدة مسبقا. وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة وسيط غسيل الأنسجة واحتضان الأجزاء في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق تقريبا للسماح لها بالالتصاق بالأطباق.

أضف 10 مل من وسط الشفاء الكامل إلى كل طبق وضعه في غرفة حاضنة معيارية ذات جو متحكم فيه مع خليط غاز عالي الأكسجين ، واغسل الغرفة ، ثم ضعها في حاضنة مدارية على طاولة ورجها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بمعدل 10 دورات في الدقيقة للسماح للوسط بالتدفق بشكل متقطع فوق الشظايا. بعد الحضانة ، لاحظ الأنسجة التي تخطط تحت تباين الطور والمجهر الضوئي المقلوب. اختر القصبات الهوائية مع حركة الشعر الناعمة الكاملة وظهارة الشعب الهوائية النابضة بالحياة لعلاج LMP اللاحق.

لعلاج LMPs ، قم بحساب مخطط الشعب الهوائية المحدد للتو وقم بتمييز كل بئر من لوحة زراعة أنسجة 12 جيدا. لكل explan نقل 0.5 مل من وسط النمو الكامل إلى أنبوب einor معقم. ثم أضف 25 ميكرولترا من مخزون l و p لكل تخطيط معالجة أو أضف 25 ميكرولترا من مركبة التحكم.

بالنسبة للتحكم ، تخلط المصانع جيدا عن طريق النقر برفق على الأنبوب. انقل الوسط المختلط إلى كل بئر من صفيحة زراعة أنسجة 12 بئر ملحوظة مع ملقط تشريح دقيق منحني. انقل كل قصبات هوائية مختارة إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة.

استمر في الحضانة في غرفة حاضنة معيارية ذات جو متحكم فيه عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف بعد 24 ساعة. استخدم PBS لغسل EXPLAN ثلاث مرات وانتقل إلى التثبيت h و e تلطيخ ومقايسة النفق. وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح هنا ، تم تمييز LMPs بتلوين nexin V عن طريق تحليل الفاكس ومسورة باستخدام حبات ميكرومتر واحد حيث كان 97٪ من MPS في nexin V إيجابي الخيال العلمي.

عادة ، تم الحصول على حوالي 2.5 ملليغرام من LMPs باتباع هذا البروتوكول. تعرضت الأنسجة القصبية من C 57 ستة فئران سوداء لعلاج السيارة و LMP. في هذا الشكل ، يكشف التحليل النسيجي المرضي لأقسام الشعب الهوائية عن تأثير LMPs على السلامة الهيكلية لظهارة الشعب الهوائية.

تحت السيطرة. Explan ، ظهارة الشعب الهوائية لم تتضرر إلى حد كبير. ومع ذلك ، في النباتات الخارجية المعالجة LMP ، تضررت طبقة الخلايا الظهارية السطحية أو فقدت ، وكانت هناك انخفاضات كبيرة في ارتفاع الخلايا الظهارية وكثافتها كما هو موضح هنا.

كان تلطيخ النفق الإيجابي ، وهو علامة على موت الخلايا المبرمج ، أكثر وضوحا في ظهارة الشعب الهوائية المعالجة LMP مقارنة بالأنسجة الضابطة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في ظروف معقمة عند إنتاج الجسيمات الدقيقة وإجراء ثقافة تخطيط الأنسجة.