مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات في خصائص الغشاء للخلايا العصبية الحسية الشمية استجابة لمنشطات الرائحة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الظهارة الشمية أولا ونقلها إلى غرفة منفوعة. الخطوة الثانية هي تحديد موقع OSN محل الاهتمام واختياره تحت المجهر.

ثم يتم تثبيت المقبض الشجيري لجهاز OSN المختار وتحليله أثناء تحفيزه بالروائح. في النهاية ، يميز تثبيت الرقعة المثقبة للمقابض التغصنية OSN الخصائص الوظيفية ل OSN على مستوى الغشاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجالات حاسة الشم ، مثل تسجيل حاسة الشم ، والخلايا العصبية الحسية ، والتعبير عن مستقبلات فن الرائحة المحددة ، وكذلك تسجيلات مشبك التصحيح.

تقديم معلومات حول خصائص الغشاء لهذه الخلايا العصبية. قم بإعداد الماصات المحفزة من زجاج ملليمتر واحد أو قم بشرائها مسحوبة مسبقا باستخدام اللهب. ثني ست ماصات حوالي سنتيمتر واحد من الطرف إلى زاوية 45 درجة.

ثم رتب الماصات ذات الأطراف الستة المنحنية حول ماصة سابعة مستقيمة، باستخدام ثقب كدليل ولفها في أنابيب الانكماش الحراري. قم بتسخين غلاف الانكماش في الطرف الآخر من الماصات. ضع المزيد من التفاف الانكماش.

هذا يجعل الماصة المحفزة سبعة براميل التحضيرية. الآن باستخدام قطبية متعددة الأسطوانات ، اسحب الماصة المحفزة للبراميل السبعة. بمجرد سحبها ، قم بتقوية التجميع ببعض الغراء الأبيض حول العيينة.

ثم اترك الغراء يجف طوال الليل من الحلول المطلوبة. يجب أن يكون محلول النيستاتين طازجا قبل استخدامه مباشرة. عند الحاجة ، قم بوزن ثلاثة ملليغرامات من النيستاتين وأضفه إلى 50 ميكرولتر من DMSO.

ثم خليط الدوامة لمدة 20 ثانية. بعد ذلك ، قم بصوتنة الخليط لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان التخفيف الكامل. أضف الآن 20 ميكرولترا من المزيج إلى خمسة ملليلتر من محلول المخزون داخل الخلايا.

مزيج Vortex لمدة 20 ثانية ، تليها دقيقتان إلى ثلاث دقائق من الصوتنة. ثم قم بتبريد محلول العمل على الثلج واحتفظ به محميا من الضوء. بهذه الطريقة يكون حل العمل جيدا لبضع ساعات.

قم بتحميل حقنة مجهزة بالميكروفيلم بمحلول عمل. سيكون جيدا لمدة ساعة من الاستخدام حتى يتم استخدامه. ومع ذلك ، احتفظ بالمحقنة المحملة عن طريق إبقائها على الجليد.

الآن اسحب بعض أقطاب التسجيل ذات الأعناق الطويلة وفتحتين ميكرون. الهدف هو الحصول على مقاومة من 15 إلى 20 ميجا أوم بمجرد تحميلها بمحلول Nystatin. أخيرا ، قم بتحميل الماصة المحفزة برائحة مخففة في الرنين. حل.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، اجعل الفئران متاحة بين أسبوعين وأربعة أسابيع. في هذا العرض التقديمي ، يتم استخدام الفئران التي تعبر عن أو IRES tau GFP باستخدام أو IS tau GFP الفئران. سيتم تصنيف جميع الخلايا العصبية التي تعبر عن أو ذات الأهمية ب GFP.

يمكن استخدام هذه الطريقة أو التعبير عنها في جميع المناطق. ومع ذلك ، سيكون التشريح والتسجيلات أسهل بالنسبة للغرف المعبر عنها في المنطقة الظهرية. ابدأ بالتخدير ثم قطع رأس الفأر.

تعتمد نتيجة هذا البروتوكول على جودة التشريح. يجب أن تكون خطوات التشريح هذه قصيرة قدر الإمكان وتكون دقيقة. لبدء الجراحة ، استخدم مقص تشريح لعمل قطع طولي على طول الظهر.

اسحب الجلد بعيدا عن بعضه لإزالته. ثم قطع على طول الفك السفلي وعمل قطع إكليلي مواز للأسنان. وبالتالي ، قم بإزالة الأسنان القاطعة العلوية.

الآن قم بعمل قطع إكليلي حول الرأس وخلف العينين ، وتخلص من الرأس الخلفي وانقل الجزء الأمامي إلى جرس مثلج. الآن تحت مجهر التشريح ، اعزل الحاجز في غضون خمس إلى 10 دقائق. ابدأ بقطع طولي على طول الجانب البطني.

ثم قطع العظام الظهرية طوليا على طول الجانب الجانبي الظهري من تجويف الأنف. بعد ذلك ، قم بإزالة معظم العظام والحنك. انقل الحاجز المعزول وقم بتوصيل الظهارة بوعاء من الرنين المؤكسجين في درجة حرارة الغرفة.

في غضون خمس دقائق ، قم بالاستعدادات النهائية قبل التسجيل. يجب ألا يكون المحلول دافئا جدا ، وإلا سيبدو التحضير تالفا. للوصول إلى الظهارة العصبية للتسجيل.

أولا ، قشر الظهارة من الحاجز الأساسي باستخدام ملقط. ثم باستخدام مقص فانا الصغير ، قم بقص الطرف الأمامي من الحاجز لتحرير الظهارة. الآن قم بإزالة عضو الأنف بعناية.

اقطعها حيث يتم توصيلها ظهريا. يمكن الآن نقل الظهارة المعزولة إلى جانب مخاط غرفة التسجيل لأعلى. بمجرد وضعه في مكانه ، استخدم قيثارة لتسطيح الأنسجة.

ثم انقل الغرفة إلى مجهر عمودي. تصور الظهارة العصبية تحت هدف الغمر في الماء 40 × مع نقعها باستمرار باستخدام جرنات جديدة في درجة حرارة الغرفة. لبدء البحث عن الخلايا ذات الأهمية ، والتي تعبر في هذه الحالة عن EGFP ، لذلك يتم استخدام ضوء 480 نانومتر للمسح بحثا عن الخلايا التي تنبعث منها الضوء في نطاق 530 إلى 550 نانومتر.

يجب تمييز المقابض التغصنية المستهدفة و osn عند مراجعتها عند 80 إلى 160 × تحت المجال الساطع بوضوح عن الخلايا الداعمة. الآن قم بتحميل القطب الكهربائي بمحلول الستاتين S. اضغط على أي فقاعات تتشكل وقم بتوصيل القطب بالحامل.

الآن قم بتطبيق بعض الضغط الإيجابي. تتراوح المقاومة المتوقعة بين 15 و 20 ميجا أوم. ثم أحضر القطب إلى الخلية مع الحفاظ على الضغط الإيجابي.

عندما تزداد المقاومة إلى حوالي 40 ميجا أوم ، حرر الضغط وقم بتطبيق ضغط سلبي طفيف. إذا تم عمل ختم جيجا ، فيجب تثبيت جهد الغشاء عند سالب 75 مللي فولت. الآن بعد أن أصبحت الخلية مفتوحة ، تابع التجربة.

قم بتطبيق التحفيز والبروتوكولات والبث مع العلاجات الدوائية حسب الحاجة للاختبار برائحة واحدة. سجل 200 إلى 500 مللي ثانية من النشاط التلقائي. ضع الرائحة لمدة 500 مللي ثانية ثم قم بقياس الاستجابات لمدة تصل إلى 10 ثوان باستخدام البروتوكول الموصوف.

MOR 23 ، التي تعبر عن الخلايا العصبية الموسومة ب EGFP ، تم ترقيعها وتحفيزها بتركيزات مختلفة من al. في ظل وضع المشبك الحالي ، فإن ليال هو رابط ل MOR 23. بدلا من ذلك ، تمت محاكاة الخلايا تحت وضع مشبك الجهد.

في تسجيلات وضع مشبك الجهد ، تمت مراقبة الخصائص المختلفة. لتحديد الاستجابة كما تم إجراؤها بشكل كلاسيكي في الفيزيولوجيا الكهربية باستخدام استجابة السعة القصوى ، تم رسم استجابة الجرعة باستخدام معادلة التل. توفر هذه النتائج معلومات حول خصائص التشفير لكل OSN، والتي تشمل عتبة الاكتشاف والمدى الزمني والديناميكي والديناميكي ومستوى التشبع.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء جزء التشريح من هذه التقنية في غضون 10 إلى 15 دقيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استكشاف الخصائص الوظيفية للخلايا العصبية الحسية الشمية التي تعبر عن مستقبلات الرائحة المحددة في الفئران.