Name: تطبيق المجسم حقن التقنية لدراسة التأثيرات الوراثية على سلوكيات الحيوان (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: استكشف تقنية الحقن المجسم لدراسة التأثيرات الوراثية على سلوكيات القلق والاكتئاب في الفئران. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تعديل تعبير جين محدد بدقة وقياس التغيرات السلوكية كمياً.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

هذا العمل مدعوم جزئيا من قبل منحة تطوير العلماء من جمعية القلب الأمريكية وجائزة NARSAD للباحث الشاب ل Yingwei Mao.

<ol><li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-transgenic+mouse+strain+for+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).</li>
<li>Hirrlinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-cre+complementation+indicates+coincident+activity+of+different+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo.</a> PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).</li>
<li>Fenno, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+with+single+vectors+using+multiple-feature+Boolean+logic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic.</a> Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+sterotaxic+coordinates%22">The mouse brain in sterotaxic coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).</li>
<li>Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mood+and+anxiety+related+phenotypes+in+mice%3A+the+open+field+test%5BTitle%5D)+AND+%22Humana+Press%22%5BJournal%5D)">Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test.</a> Humana Press. 42, 1-20 (2009).</li>
<li>Denenberg, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-field+behavior+in+the+rat%3A+W.0hat+does+it+mean%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).</li>
<li>Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+behavior+in+the+forced+swim+test%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Factors influencing behavior in the forced swim test.</a> Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).</li>
<li>Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+despair+in+rats%3A+A+new+model+sensitive+to+antidepressant+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments.</a> European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).</li>
<li>Hunsberger, J., Dunman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+depression-like+and+anxiety-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Animal models for depression-like and anxiety-like behavior.</a> Nature Protocol Exchange. , (2007).</li>
<li>Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+gene+knockdown+in+the+brain+using+viral-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference.</a> Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).</li>
<li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta%2Fbeta-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).</li>
<li>Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+5-HT1B+receptor+in+dorsal+raphe+nucleus+using+herpes+simplex+virus+gene+transfer%2C+increases+anxiety+behavior+after+inescapable+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress.</a> Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).</li>
<li>Tasan, R. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+and+basolateral+amygdala+are+critical+sites+of+neuropeptide+Y%2FY2+receptor-mediated+regulation+of+anxiety+and+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protoc+Hum+Gen%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).</li>
<li>Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetizing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Anesthetizing mice.</a> Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).</li>
<li>Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EJC+factor+RBM8a+regulates+anxiety+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors.</a> Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).</li>
<li>Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+rodent+survival+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Surgery%22%5BJournal%5D)">Guidelines for rodent survival surgery.</a> Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).</li>
<li>Wahlsten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+ready+for+testing.+Mouse+Behavioral+Testing%3A+How+to+use+mice+in+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Press%22%5BJournal%5D)">Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience.</a> Academic Press. , 133-141 (2011).</li>
<li>Kheirbek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+control+of+learning+and+anxiety+along+the+dorso-ventral+axis+of+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus.</a> Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).</li>
<li>Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hippocampal+neurogenesis+buffers+stress+responses+and+depressive+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors.</a> Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).</li>
<li>Sik-Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuronal+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+cAMP+in+the+dentate+gyrus+of+the+hippocampus+is+required+for+antidepressant-like+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).</li>
<li>Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+by+retrovirus+vectors+occurs+only+in+cells+that+are+actively+replicating+at+the+time+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection.</a> Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).</li>
<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

حقن المجسم الناجحة تعتمد على ثلاثة عوامل هي: الحفاظ على الماوس على قيد الحياة، وتحديد نقطة الصفر الصحيحة للإحداثيات (رأس الإبرة على تقاطع bregma والخط interaural)، وتحديد عمق المناسب لنقطة الصفر (رأس الإبرة مجرد لمس السطح الخارجي للأنسجة المخ). الجدوى من الفئران هو المهم. البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية يمكن بمساعدة من خلال التأكد من أن الفأر هو تخدير بشكل صحيح ويتلقى مسكن ملائم. ومن المعروف الألم أن تكون سببا رئيسيا من الفقراء الانتعاش بعد الجراحة. ضمان أن الفأر هو تخدير كامل...

وقد الماوس تستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب لأنه من السهل التلاعب وراثيا. تقنيات الجينات خروج المغلوب تسمح للباحثين للتحقيق في كيفية عمل كل عامل وراثي الأشكال السلوكيات الماوس. وعلاوة على ذلك، يوفر نظام لجنة المساواة العرقية loxp أداة قيمة لنسيجيا وخلية type- بالضربة القاضية جين معين في الفئران، والتي تمكن الباحثين لدراسة وظيفة الجينات في الأنسجة المختلفة. 1 ومع ذلك، من الناحية العملية، وأنماط التعبير من المروجين لجنة المساواة العرقية يصعب السيطرة ولقد لذلك العديد من السائقين حتى الآن لجنة المساواة العرقية التي أنشئت لم يتحقق التعبير منطقة محددة. 2،3 بدلا من ذلك، حقن المجسم هو الأسلوب الذي يستهدف مناطق محددة في الدماغ من الماوس الكبار. عن طريق حقن الفيروسات المعدلة وراثيا معربا عن كدنا] أو shRNA، لا يمكن أن يتحقق التشكيل منطقة محددة في التعبير الجيني. على الرغم من أن حجم الدماغ من كل فأر يختلف، موقع مناطق محددة في الدماغ يمكن تحديدها باستخدام coordi المجسمتعيين المتحكمة من المعالم على الجمجمة من مخ الفأر. المعالم الأكثر شيوعا هي bregma، لامدا، والخط interaural. باستخدام الإحداثيات التي تم الحصول عليها من أطلس الدماغ، 4 في المكان المحدد من كل منطقة في الدماغ يمكن تحديدها من قبل انتيرو-الخلفي (A / P)، وسطي الاطراف (M / L)، و (D / V) محاور الظهري البطني من bregma / interaural خط التقاطع. عادة الفيروسات حقنها في أدمغة الفئران الموسومة هي إما أحمر أو أخضر بروتين فلوري (RFP أو GFP)، بحيث الحقن يمكن التأكد عن طريق الفحص المجهري الفلورسنت. تقييم السلوكية للفئران ضرورية خصوصا للبحوث الأساسية من الاضطرابات النفسية. أعراض الاضطرابات النفسية لدى المرضى الذين عادة ما تشمل السلوكيات الشاذة. بعض هذه السلوكيات البشرية هي الحفظ تطويريا ويمكن تحاكي مباشرة، ولاحظ في الماوس. على سبيل المثال، والاكتئاب يمكن أن تكون على غرار في الماوس عن طريق قياس اليأس السلوكي. الأشخاص الذين يعانون من الاكتئاب كثيراأون تشعر وكأن شيئا لم يفعلوا سيساعد أي وقت مضى، من أعراض التي يمكن أن تؤدي في النهاية إلى الانتحار. في القوارض، وهذا يمكن أن تكون على غرار باستخدام اختبار السباحة القسري (FST)، والذي يقيس مقدار الوقت ماوس السباحة مقابل عائمة في بركة من الماء (ينظر إليها على التخلي). يتم التحقق من صحة هذا النموذج من قبل إنقاذ النمط الظاهري مع عقاقير مضادة للاكتئاب. 7،8،9 الفئران التي تلقت عقاقير مضادة للاكتئاب سوف تنفق أقل كثيرا من الوقت متحرك مقارنة مع الضوابط غير المعالجة. تم تصميم اختبار السلوكي آخر، الاختبار الميداني المفتوحة (OFT) لتقييم الحركة في الفئران، وبالإضافة إلى ذلك يمكن استخدامها لتحليل النمط الظاهري حريصة في الفئران. 5،6 يقوم هذا الاختبار على أساس أن الفئران يشعرون أكثر أمانا عندما تكون قريبة على الحائط في حقل مفتوح الرواية. سوف الفئران نوع البرية استكشاف في النهاية بيئة جديدة، كما أنها حيوانات غريبة. ومع ذلك، تنفق وقتا أقل في وسط الميدان يدل على القلق في الماوس، والماوس سوف لن تكون قادرة على التغلب على initiaل الخوف يأتي نتيجة للبيئة جديدة. القلق من الفأرة، وكمية من مقدار الوقت الذي يقضيه في وسط حقل مفتوح، يمكن مقارنة القلق السريرية في البشر، والتي هي موجودة في العديد من الاضطرابات النفسية. الجمع بين الحقن المجسم مع النماذج السلوكية هو وسيلة جديدة لتغيير التعبير عن جين معين في منطقة الدماغ المستهدفة. ومن ثم يمكن تحديد أثر هذان التعبير الجيني على السلوكيات الماوس. وعلى النقيض من خروج المغلوب الدماغ كله، وهذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لأنها تستهدف مناطق محددة في الدماغ فقط. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما يتم إجراء حقن المجسم في الكبار النوع البري الماوس، لذلك، وقد تم الحفاظ على الذاتية التعبير الجيني في جميع أنحاء مراحل النمو. هذه الطريقة سوف تجنب تأثير الخلط إذا كنت بحاجة الجينات من أجل البقاء خلال المرحلة الجنينية أو بعد الولادة للتنمية. أحد أوجه القصور الرئيسية هو أن فئران التجارب تحتاج إلى اجتيازهاح عملية جراحية الغازية، التي جماجم من الفئران لا بد من فتح. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد درجة التشكيل الجيني من عيار وكفاءة الفيروس. يحتاج الفيروس ليتم حقنه في المنطقة الصحيحة باستخدام الإحداثيات المجسم، الأمر الذي يتطلب أدوات خاصة. التحقق من موقع الحقن الصحيح لا يمكن إلا أن تكتمل بعد الوفاة. تم عرض هذه الطريقة تستخدم سابقا لاختبار إشراك جين معين في مختلف الأمراض العصبية. على سبيل المثال، فيروسية بوساطة رني استهداف الجين ث (الذي يسمح الدوبامين أن يتم تصنيعها) تم حقنها في المكتنزة المادة السوداء، وأجريت تحليل السلوك الحركي. استخدمت 10 دراسة أخرى حقن المجسم لإسكات DISC1 الفيروسة البطيئة لتقييم سلوك الماوس في العلاقة إلى الفصام. ضربة قاضية من DISC1 أدى إلى زيادة الحركة ردا على الجدة (التشابه الأعراض الإيجابية في انفصام الشخصية)، وزيادة الجمود فيFST. 11 وبالمثل، وجدت دراسة إضافية 5-HT 1B overexpression أدى إلى زيادة السلوك الاستكشافي في التجارة المشروعة، بما يتفق مع النمط الظاهري المضادة للقلق باستخدام هذا الأسلوب. يمكن 12 حقن المجسم تقديم فيروس لجنة المساواة العرقية للحث على إعادة التركيب في لجنة المساواة العرقية loxp الفئران . وقد استخدم هذا الأسلوب لحذف انتقائي مستقبلات Y2 في اللوزة ونواة السرير من الانتهائي السطور. بناء على التحليل السلوكي، وقد وجدت هذه الفئران إلى النمط الظاهري المضادة للاكتئاب عندما تم حذف هذا الجين في اللوزة المركزية، ولكن لا النمط الظاهري عندما تم حذف هذا الجين في اللوزة basolateral أو نواة السرير من الانتهائي السطور. 13 وهكذا، هذه التقنية يوفر أداة فريدة من نوعها لدراسة تأثير الجينات على سلوكيات الحيوان.

<table><tbody><tr><td>جهاز تجسيمي البند 51725</td><td>شركة Stoelting</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>مضخة تجسيمية مثالية&nbsp;</td><td>شركة ستويلتينج</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>حقن Styringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&nbsp;</td><td>شركة Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>مقص</td><td>أدوات جراحية دقيقة</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>ملقط نهاية حادة</td><td>أدوات جراحية دقيقة</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>حامل إبرة&nbsp;</td><td>أدوات جراحية دقيقة</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>صندوق التحكم في عزم الدوران الصغير ، قبضة Tech2000</td><td>مع دواسة</td></tr><tr><td>معقم حبة</td><td>زجاجية Inotech & nbsp ؛</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>خيوط قابلة للامتصاص&nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>قابلة للامتصاص ، قطع عكسي</td></tr><tr><td>مسحات قطنية</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>وسادة تسخين</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>دموع اصطناعية</td><td>الرجبي</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>حقنة يمكن التخلص</td> منها <td>BD حقنة</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>قفازات قماشية</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>& نب سب.</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch # 7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin أو أي مخدر</td><td>آخر انظر الاقتباس</td><td></td><td></td>من</tr><tr><td>الوصفة Ketoprofen أو غيرها من المسكنات</td><td>انظر veternarian&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>تتبع برنامج</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>تتبع كاميرا</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

تطبيق المجسم حقن التقنية لدراسة التأثيرات الوراثية على سلوكيات الحيوان

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

حقن المجسم هو تقنية مفيدة لتقديم lentiviruses عيار عالية لمناطق الدماغ المستهدفة في الفئران. Lentiviruses يمكن إما بإفراط أو التعبير الجيني ضربة قاضية في منطقة مركزة نسبيا دون أضرار جسيمة للأنسجة الدماغ. بعد الشفاء، ويمكن اختبار الماوس حقنه في مختلف المهام السلوكية مثل اختبار الحقل المفتوح (OFT) والسباحة الاختبار القسري (FST). تم تصميم OFT لتقييم الحركة والنمط الظاهري حريصة في الفئران عن طريق قياس مقدار الوقت الذي يقضيه الماوس في وسط حقل مفتوح الرواية. سوف فأر أكثر قلقا يمضون وقتا أقل بكثير في وسط الميدان رواية مقارنة بالمجموعة الضابطة. وFST يقيم النمط الظاهري المضادة للاكتئاب عن طريق قياس مقدار الوقت الذي تنفق الفئران غير متحرك عند وضعها في دلو من الماء. وهناك الفأر مع النمط الظاهري المضادة للاكتئاب تنفق أقل بكثير متحرك الوقت مقارنة للسيطرة على الحيوانات. والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام ster يسودحقن eotactic من الفيروسة البطيئة بالتزامن مع الاختبارات السلوكية لتقييم مدى عوامل وراثية تعدل سلوك الحيوان.

<html> حقن المجسم دقيق يعتمد بشكل كبير على تحديد الإحداثيات الصحيحة. يجب تعيين رأس الإبرة المستخدمة لحقن الفيروس مباشرة على تقاطع bregma والخط interaural (الشكل 1). فمن المفيد استخدام stereomicroscope للتأكد ما إذا كان أو لم يتم وضع الإبرة بشكل صحيح. عند النظر من خلال المجهر، وينبغي وضع الإبرة بحيث إذا تم حقن الفيروس، فإنه سيهبط مباشرة على تقاطع bregma والخط interaural. وهذا هو، ينبغي أن توضع في فتحة في إبرة حقنة مباشرة فوق التقاطع. في هذه الدراسة، والفيروسة البطيئ...

حقن المجسم من lentiviruses معربا عن cDNAs أو shRNAs يمكن أن تعدل التعبير الجيني في مناطق محددة في الدماغ لدى الفئران. هنا، نقدم بروتوكول الجمع بين الحقن المجسم مع المهام السلوكية، مثل الاختبار الميداني المفتوحة (OFT) والسباحة الاختبار القسري (FST).

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم كيفية تأثير تعديل تعبير جين معين في منطقة مستهدفة على سلوك الحيوان. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء فيروس لينتي (lentivirus) لتعديل تعبير الجين المستهدف. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام الحقن بالتوجيه المجسم (stereotactic injection) لحقن فيروس اللينتي في منطقة محددة من دماغ القارض ER.يمكن قياس السلوكيات التالية، مثل القلق والاكتئاب، كمياً باستخدام نماذج سلوكية معتمدة. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء الفحص النسيجي للتأكد من دقة موقع الحقن. وفي نهاية المطاف، يمكن للحقن بالتوجيه المجسم المقترن بالتقييم السلوكي أن يوضح كيف يمكن لجين معين في منطقة مستهدفة أن يؤثر على سلوكيات الفئران.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في قدرة العلماء على تغيير تعبير جين واحد في منطقة مستهدفة صغيرة، ومن ثم تقييم التغيرات السلوكية لدى الفئران. لبدء هذا الإجراء، ضع فأراً مخدراً في جهاز التوجيه التجسيمي، وثبّت القواطع الأمامية في المشبك الأمامي وأحكم إغلاق الفك. بعد ذلك، أدخل قضبان الأذن في القنوات السمعية من أجل تثبيت الرأس بشكل كامل.بعد ذلك، ضع وسادة تدفئة أسفل الفأر لتنظيم درجة حرارة جسمه. وطوال فترة الإجراء، ضع دموعاً اصطناعية على عيني القارض لمنع جفافها. بعد ذلك، قم بتنظيف المنطقة الجراحية جيداً عن طريق فرك بوفيدون يود 10% أولاً باستخدام مسحة قطنية بحركات دائرية.بعد ذلك، امسح موقع الجراحة بكحول إيثيلي 70% بنفس الطريقة. كرر إجراء التنظيف هذا مرتين إضافيتين. وبمجرد تحضير الفأر، افتح حقيبة المعدات المعقمة.قم بتغيير القفازات قبل لمس الأدوات. ثم أخرج قطعة القماش المعقمة وضع الأدوات فوقها. الآن، أمسك جلد الفأر برفق باستخدام ملقط الدم وقم بإجراء شق جراحي باستخدام المشرط.ابدأ إجراء الشق الجراحي على ارتفاع 1.5 centimeters تقريبًا فوق الأذنين، ومده حتى 0.5 centimeters تقريبًا تحت الأذنين للكشف عن bgma. وبمجرد رؤية bgma، استخدم مسحة قطنية معقمة لإزالة أي دم يغطي سطح الجمجمة برفق. ثم استخدم مسحتين قطنيتين لدفع الجلد نحو جانبي الرأس.بعد ذلك، وفي خزانة استخلاص الغازات، املأ حقنة بالفيروس المراد حقنه. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة بالداخل. ثم ضع الحقنة في جهاز التوجيه التجسيمي، مع التأكد من تثبيتها بإحكام.بعد ذلك، قم بخفض المحقنة ببطء حتى تصبح فوق سطح الجمجمة مباشرة. ثم حرك طرف إبرة المحقنة المعقمة إلى نقطة تقاطع B bgma والخط بين الأذنين (inter rural line). حدد هذه النقطة لتكون نقطة الصفر.قم بعد ذلك بتحديد إحداثيات المنطقة المستهدفة. حرك إبرة المحقنة إلى الموقع المراد حفره. ثم ضع ريشة المثقاب مباشرة فوق الموقع المستهدف بزاوية 45 درجة بالنسبة للجمجمة وابدأ في الحفر.يجب توخي الحذر لعدم الحفر داخل الدماغ من أجل منع تلف القشرة الدماغية. بعد ذلك، قم بتنظيف أي دم من الثقب باستخدام مسحة قطنية معقمة. اخفض المحقنة بحيث تستقر طرفها مباشرة على سطح الدماغ.اضبط إحداثيات DV على الصفر، ثم اخفض المحقنة إلى العمق المطلوب. ابدأ الآن عملية الحقن بمعدل 0.2 µL في الدقيقة. بعد انتهاء الحقن، انتظر لمدة دقيقتين تقريبًا لضمان امتصاص أي فيروس متبقٍ.ثم ارفع المحقنة ببطء. استخدم مسحة قطنية لتنظيف أي سائل من موقع الحقن. بعد ذلك، قم بخياطة الجلد وإخراج الحيوان من الجهاز الاستريوتاكسي.أبقِ الفأر على وسادة التدفئة حتى يستيقظ، وقدم مسكناً إضافياً للألم عند الحاجة. في هذا الإجراء، أحضر ساحة بلاستيكية مربعة. نظف الساحة باستخدام 70% ethyl alcohol قبل التجربة.بعد ذلك، ضع الساحة على الأرض وتأكد من ضبط الإضاءة لتقليل الظلال والوهج. ثم اضبط إعدادات الكشف بحيث يظهر الفأر بوضوح على الشاشة. بعد ذلك، قم بتشغيل الكاميرا لتسجيل المهمة السلوكية وضع الفأر باتجاه منتصف مقدمة الساحة بحيث يكون مواجهاً للجدار.اضبط الموقت على خمس دقائق ثم ابتعد عن الساحة أو غادر الغرفة. بعد مرور خمس دقائق، انقل الفأر مرة أخرى إلى القفص. استخدم كحول إيثيلي بتركيز 70% لتنظيف الساحة جيداً قبل الانتقال إلى الحيوان التالي.الآن، املأ دلوًا شفافًا بسعة لترين بالماء عند درجة حرارة 22 °C. ضع الدلو على الأرض وتأكد من ضبط الإضاءة لتقليل الظلال والوهج. في حال استخدام برنامج تتبع، ضع الكاميرا مباشرة فوق الدلو.اضبط إعدادات البرنامج بحيث يكون الفأر مرئياً بوضوح على الشاشة. ثم قم بتشغيل الكاميرا لتسجيل المهمة السلوكية. ضع الفأر بلطف في منتصف دلو الماء بحيث تكون أقدامه الأمامية.المس الماء أولاً وامنع رأس الفأر من الغمر. بعد ذلك، اضبط المؤقت على ست دقائق قبل الابتعاد عن منطقة السلوك. بعد مرور ست دقائق، أخرج الفأر من الدلو، وامسح الماء الزائد قبل إعادته إلى القفص.إليك شريحة دماغية نموذجية، توضح نجاح حقن الفيروس في التلفيف المسنن. يوضح هذا الشكل مقدار الوقت الذي قضاه كل من الفئران الضابطة والفئران التجريبية في مركز مجال مفتوح جديد. قضت الفئران التجريبية وقتاً أقل بكثير في مركز الساحة، مما يشير إلى ظهور نمط ظاهري للقلق، ويوضح هذا الشكل مقدار الوقت الذي تظل فيه الفئران الضابطة والتجريبية ساكنة في اختبار السباحة القسرية.لم تكن الفئران التجريبية مختلفة بشكل ملحوظ عن مجموعة الضابطة في مقدار الوقت الذي قضته في حالة عدم الحركة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يتكون لدى المشاهدين تصور جيد عن كيفية استخدام الحقن بالتوجيه المجسم لتقييم سلوكيات القوارض.

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Research

JoVE Journal

Behavior

سلوك

المصدر: Porlan، E.، et al. تعديل جيني مستقر وفعال للخلايا في الفأر البالغ V-SVZ لتحليل التأثيرات المستقلة وغير المستقلة للخلايا الجذعية العصبية. J. Vis. Exp. (2016)يوضح هذا الفيديو التعديل الجيني المستقر للخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في المنطقة البطينية تحت البطينية (V-SVZ) من خلال الحقن التجسيمي لجين علاجي يحمل الفيروس في نموذج الفأر. يدخل الفيروس إلى NSCs ، ويخضع للنسخ العكسي ، ويتكامل في الجينوم ، ويتيح التعديل الجيني المستقر والفعال لتطبيقات العلاج العصبي.

الحقن التجسيمي للفيروسات من أجل تعديل جيني مستقر في نموذج الفأر

المصدر: Fricano-Kugler, C. J., et al. تصميم وتعبئة وتسليم فيروسات CRISPR الرجعية عالية الارتفاع والعدسات عبر الحقن التجسيمي. J. Vis. Exp. (2016)يوضح هذا الفيديو الحقن الفيروسي التجسيمي لتحرير الجينات العصبية بدقة في دماغ الفأر. يضمن البروتوكول توصيل الفيروس بدقة إلى التلفيف المسنن ، مما يتيح وضع العلامات الفلورية والضربة القاضية الجينية بوساطة كريسبر لدراسة الدوائر العصبية ووظيفة الجينات وآليات المرض في الجسم الحي.

الحقن الفيروسي التجسيمي لتحرير الجينات العصبية المستهدفة في دماغ الفأر

توضح هذه المقالة كيفية microinject ناقلات فيروسية في مخ الفأر ثم اختبار في تفضيل مكان الهواء نموذج يتضمن مرحلة الاستحواذ، وإعادة الانقراض.

حقن مكروي التجسيمي من ناقلات فيروسية وإذ تعرب عن لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور إلى دراسة دور الجينات المستهدفة في الكوكايين مكيفة مكان ميول

هنا نصف إجراء يعتمد على استخدام جزيئات الفيروسات العدسية للتعديل الجيني طويل المدى للخلايا الجذعية العصبية و / أو الخلايا البطانية العصبية المجاورة لها في مكانة عصبية البطين تحت البطين البالغة والتي تسمح بتحليل منفصل للخلايا المستقلة وغير المستقلة والمعتمدة على الخلايا الجذعية العصبية.

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

توضح هذه المقالة كيفية حقن ناقلات فيروسية في القشرة الأمامية الماوس لاختبار المقايسات السلوكية التي تتطلب هذه العملية من تشكيل مغايرة التغصن.

وساطة من HSV-التعبير التحوير من همي التركيبات لدراسة وظيفة السلوكية من هذه العملية من Heteromers في الفئران

يصف لنا على بروتوكول لجراحة ستيريوتاكسيك مع جهاز ثابت رئيس محلية صنع الكاشفات ميكروينجيكتينج في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. هذا الأسلوب يتيح التلاعب بالجينات في الخلايا العصبية في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.

جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

يصف هذا البروتوكول مجموعة من الطرق لتحديد الاتصال الوظيفي الخاص من نوع الخلية من المدخلات طويلة المدى من مناطق الدماغ البعيدة باستخدام التحفيز البصري في شرائح الدماغ في الجسم الحي السابق.

في فيفو الحقن المجسمة داخل الدماغ لتحفيز البصريات من المدخلات بعيدة المدى في شرائح الدماغ الماوس

لا يزال دور الجينات المرتبطة بالمرض المكتشفة مؤخرًا في التسبب في الاضطرابات العصبية والنفسية غامضًا. تعديل ثنائي في تقنية الكهربائي الرحم يسمح لنقل الجينات في مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية وفحص الآثار المسببة لتغيرات التعبير الجيني على السلوك الاجتماعي.

خط أنابيب باستخدام ثنائي في القطب الرحمي لاستجواب التأثيرات الوراثية على سلوك القوارض

يصف هذا البروتوكول استراتيجية عملية للتعجيل بخطوة التحقق من إحداثيات الحقن التجسيمي قبل إجراء تتبع الفيروس باستخدام الأصباغ والأقسام المجمدة.

التحقق الأولي من إحداثيات الحقن التجسيمي عن طريق التقسيم بالتبريد

MicroRNAs لها أدوار هامة في بنية الدماغ ووظيفته. هنا نحن تصف طريقة لفرض ميرنا الحصين الإفراط في التعبير باستخدام حقن المجسم من الفيروسة البطيئة ميرنا، معربا عن هندسيا. يمكن لهذا النهج بمثابة وسيلة سريعة نسبيا...

حقن المجسم من الرنا الميكروي، معربا عن Lentiviruses إلى CA1 الحصين ماوس المنطقة وتقييم حصيلة السلوكية

استكشف تقنية الحقن المجسم لدراسة التأثيرات الوراثية على سلوكيات القلق والاكتئاب في الفئران. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تعديل تعبير جين محدد بدقة وقياس التغيرات السلوكية كمياً.

تطبيق المجسم حقن التقنية لدراسة التأثيرات الوراثية على سلوكيات الحيوان

استكشف المزيد من الفيديوهات