استخدام استراتيجية قفيصة التأسيس Antigen ل تطوير المناهج اتش المصلي 5 تنقلها لقاح

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام استراتيجية دمج أغطية المستضد لتطوير مناهج لقاح النمط المصلي للفيروس الغدي الخمسة باستخدام ناقل فيروسات غدية ثنائي التلفاز كدليل على المبدأ باستخدام استراتيجية دمج قفيصة المستضد ، يتم استخدام خطوات استنساخ متعددة لبناء البلازميد المعدل ، A D خمسة R واحد K-W-S-H-V-R خمسة هسهسة. بعد ذلك ، ناقل الأدينيل الفيروسي ثنائي التكافؤ. R واحد K كان HVR خمسة.

يتم إنقاذ الهسهسة ونشرها وتنقيتها. ثم يتم تمييز العيارات الفيروسية وعرض المستضدات المدمجة على القفيصة الفيروسية. أخيرا ، يتم تقييم إمكانات ناقل عدن الفيروسي ثنائي التكافؤ للتحايل على التحييد بواسطة مصل D خمسة إيجابي باستخدام استراتيجية دمج قفيصة المستضد.

يتم استخدام خطوات استنساخ متعددة لبناء البلازميد المعدل ، A D خمسة R واحد K-W-A-S-H-V-R خمسة هسهسة. سنعرض اليوم استراتيجية دمج القفيصة المستضد. هذه الإستراتيجية مفيدة مقارنة بالاستراتيجيات الأخرى مثل طريقة التعبير عن الجينات المعدلة لأنها لا تعرض فقط المستضد المثير للاهتمام على الفيروس الغدي الأسير كبروتين ، ولكنها تسمح باستجابة خلطية قوية ضد هذا المستضد.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم الخطوات المتعلقة بتوليد الفيروس الغدي المعدل للغطاء لأن العديد من المتغيرات تساهم في تطوير النواقل الفيروسية الموصى بها ، مثل اختيار إنزيمات التقييد ، وعدسة الطاقة ذات الأهمية في الآخرين توضيح الإجراءات. سيكون اليوم اثنين من باحثي ما بعد الدكتوراه ، الدكتور لين لين جو ، والدكتورة نيترا فارو. أيضا ألكسندر كرين ، الباحث المشارك في المختبر لبناء البلازميد المكوكي ، أضف ست وحدات لكل من GE واحد و CCC من واحد إلى ستة ميكروغرام من HVR جزء KWA.

احتضان تفاعل الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. قم بحل الجزء الهضمي في هلام agros بنسبة 2٪ عن طريق الرحلان الكهربائي واستخدم مجموعة استخراج هلام الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لتنقية الشظية. بعد ذلك ، قم بربط 12 نانوغراما من الجزء المنقى في موقعي G واحد و ACC واحد من 100 نانوجرام من البلازميد المكوكي الذي تم إنشاؤه مسبقا.

HVR خمسة همسة ستة درجة حموضة خمسة ثوان وحجم تفاعل 10 ميكرولتر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ثم أضف ميكرولتر واحد من تفاعل الربط إلى 50 ميكرولترا من خمس خلايا ألفا DH ذات الكفاءة الكهربائية ، وثمانية كهربائية قبل إضافة 950 ميكرولتر من وسط SOC. احتضان الخلايا المحولة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة قبل نشر 100 إلى 200 ميكرولتر من المزرعة على صفيحة LB CANY.

احتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. استخدم ست وحدات لكل من Echo R one و PME واحد لهضم ستة ميكروغرامات من البلازميد المكوكي المنقى عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد تنقية الجزء الذي يحتوي على أذرع إعادة التركيب المتجانسة والجين المزدوج المعدل الخامس ، استخدم SUA واحد لخطية البلازميد الفقري ، PAD five ، دلتا H خمسة لإجراء إعادة تركيب متماثل.

استخدم التثقيب الكهربائي لتحويل 100 نانوجرام لكل جزء من جزء المكوك المنقى وبلازميد العمود الفقري إلى 50 ميكرولتر من خلايا BJ 5 180 3 ذات الكفاءة الكهربائية. كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو في اليوم التالي ، اختر ما يقرب من 10 مستعمرات في ثلاثة ملليلتر من LB السائل الذي يحتوي على علبة المايسين وتنمو بين عشية وضحاها قبل الفحص وفقا لبروتوكول النص. ثم قم بتحويل 100 نانوجرام من البلازميد المنقى إلى خمس خلايا ألفا DH كما هو موضح سابقا لإنقاذ ناقل الفيروس المضاف.

ابدأ باستخدام PAC one لخطية 15 ميكرولترا من المتجه بحجم 100 ميكرولتر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات بعد الهضم. لاستخراج البلازميد الخطي تحت غطاء الدخان.

أضف حجما متساويا من كلوروفورم الفينول ، كحول الأيزواميل إلى جهاز الطرد المركزي للتفاعل عند 10 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة وجمع المادة الطافية قبل تكرار الاستخراج وتدويرها إلى الحجم المستخرج. أضف 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ و 10 ميكرولتر من الأسيتات عند 10،000 جم لمدة 10 دقائق. ثم بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 700 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول قبل الدوران مرة أخرى.

بمجرد إعادة تعليق الحبيبات وتحديد الحمض النووي كميا ، قم بنقل ثلاثة ميكروغرامات من البلازميد الخطي جنبا إلى جنب مع كاشف التعداء الشحمي التجاري في قارورة T 25 المعدة مسبقا من 80٪ خلايا HEK 2 93 المتجمعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد الحضانة لمدة ست ساعات ، استبدل وسط التعدي بوسط كامل قبل إعادة القارورة إلى الحاضنة. عندما تطور اللويحات تأثيرا خلويا كاملا أو CPE تحت غطاء معقم ، اكشط الخلايا المتبقية من القارورة وقم بالطرد المركزي للثقافة عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم استخدم ملليلتر واحد من الوسط الذي يحتوي على 2٪ FBS لإعادة تعليق بيليه الخلية. بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا عن طريق إجراء أربع جولات من الذوبان بالتجميد ، ثم قم بالطرد المركزي للمحللات عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية S التي تحتوي على الفيروس الذي تم إنقاذه لنشر الناقل الفيروسي على ثقافة واسعة النطاق.

ثلث كل المحللة الفيروسية من قارورة T 25 إلى قارورة T 75 تحتوي على خلايا HEK 2 93. بعد السماح ل CPE الكامل بالتطور وحصاد supinate كما هو موضح سابقا ، قم بنشر نصف الفيروس في واحد أو أكثر. ثم تقوم T 1 75 قارورة من خلايا هونج كونج 2 93 بنشر الفيروس المعزول من قارورة T 1 75 في اثنتي عشرة أو أكثر.

T 1 75 قارورة من الخلايا بعد تحضير نقطة واحدة 33 جرام لكل مليلتر و 1.45 جرام لكل مليلتر. تضيف محاليل كلوريد السيزيوم أربعة ملليلتر ، 1.33 جرام لكل مليلتر ، كلوريد السيزيوم إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق وتضيف أربعة مليلتر ، 1.45 جرام لكل مليلتر ، كلوريد السيزيوم على قاع نفس الأنبوب. أضف أربعة ملليلتر من المحلل الفيروسي إلى الجزء العلوي من نفس الأنبوب ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 110 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات.

سيؤدي ذلك إلى فصل نطاق الفيروس السفلي الناضج عن نطاق الفيروس العلوي المعيب أسفل الغطاء. استخدم إبرة قياس 33 متصلة بحقنة سعة ثلاثة ملليلتر لتجميع الشريط السفلي. ثم استخدم خمسة هيبيين لرفع المحلول إلى أربعة ملليلترات.

ثم بعد تحضير تدرجين آخرين من كلوريد السيزيوم ، قم بتحميل الفيروس المخفف في الأعلى وقم بالطرد المركزي للتدرجات عند 110 ، 000 جم وأربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تحت غطاء المحرك. اجمع الشريط الفيروسي كما هو موضح للتو.

ثم استخدم إبرة قياس 33 وحقنة سعة ثلاثة ملليلتر لحقن محلول الفيروس في شريط غسيل الكلى. وضع كاسيت في 700 مل من مخزن غسيل الكلى واحد × معد وفقا لبروتوكول النص ، واستبدال المخزن المؤقت أربع مرات كل ثلاث ساعات. ثم باستخدام إبرة وحقنة.

اجمع المحلول الفيروسي من الكاسيت لتحديد العيار الفيزيائي الفيروسي. استخدم المخزن المؤقت لتحلل الفيروس لتخفيف كل من الفيروس والمخزن المؤقت لغسيل الكلى المستخدم كعنصر تحكم في الخلفية عند واحد إلى 10 وواحد إلى 20 واحتضان جميع الأنابيب عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتشغيل مقياس ضوئي حيوي واضبط وضع الامتصاص على كثافة بصرية تبلغ 260 نانومتر.

استخدم المخزن المؤقت لغسيل الكلى المخفف إلى واحد إلى 10 لموازنة إشارة الخلفية بالنقر فوق الزر الفارغ. اكتب 10 زائد 90 على شاشة مقياس الضوء الحيوي. استبدل الأنبوب بأنبوب من الفيروس مخفف إلى واحد إلى 10 واقرأ إشارة الفيروس المخففة إلى واحد إلى 10.

لقياس التخفيف من واحد إلى 20 ، استخدم المخزن المؤقت لغسيل الكلى المخفف إلى واحد إلى 20 لموازنة الخلفية التي تكتب خمسة زائد 95 على الشاشة قبل استبدال الأنبوب العازل بأنبوب فيروس مخفف من واحد إلى 20 وقراءة الإشارة. اضرب رقمي قراءات الفيروس في 1.1 في 10 في 12 واحسب متوسط العيار بوحدات VP لكل مليلتر بناء على العيارين الفرديين من الديلو. قم بتقييم الفيروس في الفئران وفقا للبروتوكول النصي لتوضيح ما إذا كان الفيروس الذي تم إنقاذه يعرض مستضد فيروس نقص المناعة البشرية وعلامة hist على سطح القفيصة الفيروسية.

البروتين الرئيسي هيون خمسة. تم تنفيذ إليزا مع الجسم المضاد البشري F خمسة أحادي النسيلة والجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد للعلامة الهسهسة على التوالي كما هو موضح هنا ، يضيف كل من الجسم المضاد F Five البشري والجسم المضاد للفأر المضاد للهسهسة المرتبط بثنائي التكافؤ خمسة جسيمات فيروس ، في حين لم يكن هناك ارتباط بالتحكم السلبي. تم استخدام تحليل دم غربي خماسي نواقل لتأكيد بيانات E iza حيث اكتشف كل من الجسم المضاد F خمسة والجسم المضاد للفأر المضاد للهسهسة نطاقات محددة حول 117 كيلودالتون فقط.

في ال [ديفولنت] يضيف خمسة حميات, أي يماثل إلى حجم من [هون] خمسة بروتين. لتقييم إمكانات إضافة خمسة فيروسات تم إنشاؤها للتحايل على التحييد بإضافة خمسة إيجابيات ، تم إجراء اختبار تحييد. تظهر النتائج أن وحدات الإنارة النسبية أو rlu كانت أعلى ب 12 مرة عندما تمت معالجة مضافة خمسة ناقلات مضافة للتحكم دون إضافة خمسة مصل إيجابي مقارنة بأنها عولجت بالمصل مما يشير إلى أن الفيروس قد تم تحييده.

في المقابل ، كان هناك اختلاف بسيط في استخدام R لفيروس AD ثنائي التكافؤ المبني بين العينات المعالجة وغير المعالجة مما يشير إلى أن الفيروس المبني نجا من التحييد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أكبر لنهج دمج القفيصة المستضد لتطوير لقاح مضاف خمسة نواقل. حاليا ، نستخدم هذه الإستراتيجية مع نواقل النمط المصلي النادرة.

يمكنك القيام بذلك أيضا.