استخدام استراتيجية قفيصة التأسيس Antigen ل تطوير المناهج اتش المصلي 5 تنقلها لقاح

الهدف العام من هذا الإجراء هو الاستفادة من استراتيجية دمج الكابسيدات المستضدية لتطوير مناهج لقاحات موجهة باستخدام الفيروس الغدي من النمط المصلي 5، وذلك باستخدام ناقل فيروس غدي ثنائي التكافؤ كإثبات للمبدأ. ومن خلال استخدام استراتيجية دمج الكابسيد المستضدية، تُستخدم خطوات استنساخ متعددة لبناء البلازميد المعدل، A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss. بعد ذلك، يتم تجهيز الناقل الفيروسي الغدي ثنائي التكافؤ R one K was HVR five.

يتم استعادة Hiss وإكثاره وتنقيته. ثم يتم توصيف العيارات الفيروسية والعرض المستضدي للمستضدات المدمجة على القفيصة الفيروسية. وأخيرًا، يتم تقييم قدرة الناقل الفيروسي Aden ثنائي التكافؤ على تجنب التعادل بواسطة أمصال إيجابية لـ D five باستخدام استراتيجية دمج المستضد في القفيصة.

تُستخدم خطوات استنساخ متعددة لبناء البلازميد المعدل A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss. سنقوم اليوم بتوضيح استراتيجية دمج المستضد في القفيصة. وتعد هذه الاستراتيجية مفيدة مقارنة باستراتيجيات أخرى، مثل طريقة التعبير عن الجين المنقول، لأنها لا تكتفي بعرض المستضد المطلوب على قفيصة الفيروس الغدي كبروتين، بل تتيح أيضاً استجابة خلطية قوية ضد ذلك المستضد.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم الخطوات المتعلقة بإنتاج الفيروس الغدي المعدل للغطاء نظراً لتعدد المتغيرات التي تساهم في تطوير الناقلات الفيروسية الموصى بها، مثل اختيار إنزيمات التقييد، وطول الجين المستهدف من بين أمور أخرى في توضيح الإجراءات. سينضم إلينا اليوم باحثا ما بعد الدكتوراه، الدكتورة Lin Lin Gu والدكتورة Nitra Farrow، بالإضافة إلى Alexandre Kren، الباحث المساعد في المختبر. لبناء البلازميد المكوك، أضف ست وحدات من كل من GE one و CCC one إلى 6 µg من قطعة HVR one KWA.

قم بتحضين تفاعل الهضم عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات. ثم قم بفصل شظية الهضم باستخدام الرحلان الكهربائي في هلام أغاروز بتركيز 2%، واستخدم طقم استخلاص الحمض النووي من الهلام وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة لتنقية الشظية. بعد ذلك، قم بربط 12 ng من الشظية المنقاة في مواقع a G one و ACC one لـ 100 ng من بلازميد المكوك الذي تم بناؤه مسبقاً.

HVR five hiss six pH five s وحجم تفاعل 10 µL في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ثم أضف 1 µL من تفاعل الربط إلى 50 µL من خلايا DH five alpha ذات الكفاءة الكهربائية، electro eight قبل إضافة 950 µL من وسط SOC. يتم تحضين الخلايا المحولة عند 37 °C وبسرعة 200 RPM لمدة ساعة واحدة قبل فرد 100 إلى 200 µL من المزرعة على طبق LB CANY.

تُحضن العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية. استخدم ست وحدات من كل من Echo R one و PME one لهضم 6 micrograms من البلازميد المكوكي المُنقى عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد تنقية القطعة التي تحتوي على أذرع إعادة الاندماج المتماثل وجين exon five المعدل المزدوج، استخدم SUA one لخطّ بلازميد العمود الفقري، PAD five، و delta H five لإجراء عملية إعادة الاندماج المتماثل.

استخدم التثقيب الكهربائي لإجراء تحول مشترك لـ 100 نانوجرام من كل من قطعة المكوك المنقاة وبلازميد العمود الفقري في 50 ميكرولتر من خلايا BJ 5 180 3 المختصة كهربائياً. كما تم توضيحه سابقاً في هذا الفيديو، قم في اليوم التالي باختيار ما يقرب من 10 مستعمرات في 3 مليلتر من وسط LB السائل المحتوي على الكاناميسين، وتنميتها طوال الليل قبل الفحص وفقاً لبروتوكول النص. بعد ذلك، قم بتحويل 100 نانوجرام من البلازميد المنقى إلى خلايا DH five alpha كما تم توضيحه سابقاً لاستعادة الناقل الفيروسي add.

ابدأ باستخدام PAC one لخطنة 15 µL من الناقل في حجم 100 µL. يتم التحضين عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات بعد عملية الهضم. لاستخلاص البلازميد المخطن تحت غطاء سحب الأدخنة.

أضف حجماً مساوياً من الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل إلى أنبوب الطرد المركزي للتفاعل، ثم قم بالطرد المركزي عند 10,000 G لمدة دقيقة واحدة، واجمع السائل الطافي قبل تكرار عملية الاستخلاص والدوران حتى الوصول إلى الحجم المستخلص. أضف 300 µL من الإيثانول بتركيز 100% و 10 µL من الأسيتات، ثم قم بالطرد المركزي عند 10,000 G لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تخلص من السائل الطافي وأضف 700 µL من الإيثانول بتركيز 70% قبل إجراء عملية الطرد المركزي مرة أخرى.

بمجرد إعادة تعليق الراسبة وتقدير كمية الـ DNA، قم بنقل ثلاثة ميكروغرام من البلازميد الخطي مع كاشف ترانسفكشن ليبوزومي تجاري إلى قارورة T 25 مُعدة مسبقًا تحتوي على خلايا HEK 2 93 بنسبة تلاحم 80%، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد التحضين لمدة ست ساعات، استبدل وسط الترانسفكشن بوسط كامل قبل إعادة القارورة إلى المحضن. وعندما تظهر اللويحات تأثيرًا اعتلاليًا خلويًا كاملاً أو CPE تحت غطاء معقم، قم بكشط الخلايا المتبقية من القارورة وطرد المزرعة مركزياً عند 300 G ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، استخدم 1 mL من الوسط الذي يحتوي على 2%FBS لإعادة تعليق كريات الخلايا. ثم قم بتكسير الخلايا عن طريق إجراء أربع دورات من التجميد والإذابة، وبعد ذلك قم بطرد المستخلص مركزياً عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية S التي تحتوي على الفيروس المستعاد لإكثار الناقل الفيروسي في مزرعة واسعة النطاق.

انقل ثلث إلى كل كمية من المستخلص الفيروسي من دورق T 25 إلى دورق T 75 يحتوي على خلايا HEK 2 93. بعد السماح بتطور التأثير المرضي للخلايا (CPE) بشكل كامل وجمع الراشح كما تم توضيحه مسبقاً، قم بإكثار نصف إجمالي الفيروس في دورق واحد أو أكثر من دوراق T 1 75 التي تحتوي على خلايا HK 2 93، ثم قم بإكثار الفيروس المعزول من دوراق T 1 75 في اثني عشر دورقاً أو أكثر.

قم بنقل الخلايا من 75 دورقاً من نوع T 1 بعد تحضير محاليل كلوريد السيزيوم بتركيز 1.33 جرام لكل ملليلتر و1.45 جرام لكل ملليلتر. أضف 4 ملليلتر من كلوريد السيزيوم بتركيز 1.33 جرام لكل ملليلتر إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي الفائق، ثم أضف 4 ملليلتر من كلوريد السيزيوم بتركيز 1.45 جرام لكل ملليلتر في قاع نفس الأنبوب. أضف 4 ملليلتر من الرائق الناتج عن تحلل الفيروسات إلى أعلى الأنبوب نفسه، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 110,000 G ودرجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

سيؤدي ذلك إلى فصل حزمة الفيروس السفلية الناضجة عن حزمة الفيروس العلوية المعيبة تحت الغطاء. استخدم إبرة بقياس 33 gauge متصلة بمحقنة سعة 3 mL لجمع الحزمة السفلية. ثم استخدم خمس قطرات لرفع حجم المحلول إلى 4 mL.

بعد ذلك، وبعد تحضير تدرجيْن إضافيين من كلوريد السيزيوم، قم بتحميل الفيروس المخفف على السطح، ثم قم بطرد التدرجات مركزياً عند 110,000 G ودرجة حرارة 4 °C طوال الليل. وذلك داخل جهاز الطرد المركزي. ثم اجمع الحزمة الفيروسية كما تم توضيحه للتو.

بعد ذلك، استخدم إبرة قياس 33 ومحقنة سعة ثلاثة ملليلتر لحقن محلول الفيروس في كاسيت ديالزة. ضع الكاسيت في 700 ملليلتر من محلول درء ديالزة بتركيز 1x تم تحضيره وفقاً للبروتوكول المكتوب، مع استبدال المحلول أربع مرات كل ثلاث ساعات. ثم باستخدام إبرة ومحقنة.

اجمع المحلول الفيروسي من الكاسيت لتحديد العيار الفيزيائي للفيروس. استخدم محلول تحليل الفيروس لتخفيف كل من الفيروس ومحلول الديلزة المستخدم كعنصر تحكم خلفي بنسبة 1 إلى 10 و1 إلى 20، ثم قم بحضن جميع الأنابيب عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتشغيل مقياس الضوء الحيوي واضبط وضع الامتصاص على كثافة ضوئية تبلغ 260 نانومتر.

استخدم محلول الديلزة المخفف بنسبة 1:10 لمعايرة إشارة الخلفية من خلال النقر على زر الفراغ (blank). اكتب 10+90 على شاشة المقياس الحيوي الضوئي (bio photometer). استبدل الأنبوب بأنبوب يحتوي على الفيروس المخفف بنسبة 1:10، ثم اقرأ إشارة الفيروس المخفف بنسبة 1:10.

لقياس التخفيف بنسبة 1 إلى 20، استخدم محلول غسيل الدياليز المخفف بنسبة 1 إلى 20 لموازنة الخلفية بكتابة 5 + 95 على الشاشة قبل استبدال أنبوبة المحلول بأنبوبة فيروس مخففة بنسبة 1 إلى 20 وقراءة الإشارة. اضرب رقمي قراءة الفيروس في 1.1 × 10¹² واحسب متوسط العيار بوحدات VP لكل مل بناءً على العيارين الفرديين من التخفيفين. قم بتقييم الفيروس في الفئران وفقاً لبروتوكول النص لإثبات ما إذا كان الفيروس المسترد يظهر مستضد HIV المستضدي وعلامة hist على سطح القفيصة الفيروسية.

تم إجراء تحليل إليزا (ELISA) للبروتين الرئيسي Heon five باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة human two F five والأجسام المضادة أحادية النسيلة mouse anti hiss tag على التوالي كما هو موضح هنا، حيث ارتبط كل من الجسم المضاد human two F five والجسم المضاد mouse anti hiss بجزيئات فيروس divalent add five، بينما لم يحدث أي ارتباط مع ضابط السلبية A5 vector. واستُخدم تحليل لطخة ويسترن (Western blot) لتأكيد بيانات تحليل إليزا، حيث كشف كل من الجسم المضاد human two F five والجسم المضاد mouse anti hiss عن حزم محددة عند حوالي 117 kilodaltons فقط.

في فيروس DIVALENT add five، والذي يتوافق مع حجم بروتين Heon five. ولتقييم قدرة فيروس add five المُصنّع على تجنب التحييد بواسطة add five الإيجابية، تم إجراء مقايسة تحييد. وتظهر النتائج أن وحدات الإضاءة النسبية (rlu) كانت أعلى بـ 12 مرة عندما عولج ناقل control add five بدون مصل add five الإيجابي مقارنة بما كانت عليه عند معالجته بالمصل، مما يشير إلى أن الفيروس قد تم تحييده.

في المقابل، كان هناك اختلاف طفيف في استخدام R لفيروس AD five ثنائي التكافؤ المصنع بين العينات المعالجة وغير المعالجة، مما يشير إلى أن الفيروس المصنع قد أفلت من التعادل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك رؤية أعمق لنهج دمج القفيصة المستضدية لتطوير لقاح ناقل add five. حالياً، نستخدم هذه الاستراتيجية بالاقتران مع ناقلات من الأنماط المصلية النادرة.

يمكنك القيام بذلك أيضاً.