طرق التثقيف عظم الفخذ الإنسان إإكسبلنتس الأنسجة لدراسة سرطان الثدي الاستعمار خلية للالمتخصصة الإنتقالية

يتم وصف البروتوكولات لدراسة سرطان الثدي هجرة الخلايا وانتشارها والاستعمار في نسيج العظام نظام نموذجي يزدرع البشري.

الهدف من هذا الإجراء هو دراسة تكاثر خلايا سرطان الثدي واستعمارها وهجرتها في نظام نموذج تخطيط أنسجة العظام البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل شظايا أنسجة العظام التربيقية من العينات الجراحية لرأس الفخذ وزراعتها بخلايا سرطان الثدي التي تعبر عن لوسيفيراز وبروتين الفلورسنت الأخضر. يستخدم التصوير الحيوي لقياس تكاثر الخلايا والتحقق من استعمار خلايا سرطان الثدي في شظايا أنسجة العظام.

يتم تصوير أنماط استعمار خلايا سرطان الثدي عن طريق الفحص المجهري الفلوري. يمكن شطف حجرة النخاع من الشظايا لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق فحوصات اللمعان والتلطيخ. يتم قياس هجرة خلايا سرطان الثدي نحو زراعة الأنسجة والمواد الطافية وشظايا أنسجة العظام في غرف هجرة Transwell مع تصوير التلألؤ البيولوجي العظام هي الموقع الأكثر شيوعا لورم خبيث لسرطان الثدي ، وفي النهاية يوفر هذا النموذج نافذة جديدة لدراسة خلايا سرطان الثدي داخل مكانة النقيلية للعظام.

تتمثل إحدى المزايا الكبيرة لهذا النموذج في أنه يوفر وصولا مباشرا إلى البيئة المكروية لشظايا أنسجة العظام البشرية ، مما يسمح لنا بمراقبة وتحليل سلوك خلايا سرطان الثدي بسهولة أثناء تجارب الزراعة المشتركة قصيرة المدى. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الأسئلة الرئيسية حول الآليات الكامنة وراء سرطان الثدي ، والنقائل إلى العظام بهدف تحديد الاستراتيجيات العلاجية للوقاية منه وعلاجه بشكل فعال. على الرغم من أن هذا النموذج يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة على ورم خبيث لسرطان الثدي ، إلا أنه يمكن استخدامه أيضا لدراسة الأورام الخبيثة الأخرى التي تبحث عن العظام ، مثل سرطان البروستاتا.

يجب حصاد شظايا أنسجة العظام في نقاط مختلفة في كل فحص. يبدأ هذا بجمع ونقل عينة الفخذ في محلول ملحي وإعداد محطة العمل في خزانة السلامة البيولوجية مرتدية قفازا جراحيا. أمسك رأس عظم الفخذ بيد واحدة واستخدم الخام الجراحي لاستخراج العظم التربيقي.

تظهر الشظايا حوالي ملليمترات إلى خمسة ملليمترات. لن تعمل الملقط في هذه الخطوة. أنت بحاجة إلى خام جراحي عالي الجودة.

لهذه التجربة ، قم بإعداد معلق لخلايا سرطان الثدي مع 100،000 خلية لكل 50 ميكرولتر من DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد سدادات من شمع العظام لتعبئة شظايا العظام باستخدام نهايات القطع لطرف الماصة الدقيقة ، وقم بتخزين المقابس في طبق بتري. ثم باستخدام الملقط ، انقل المقابس إلى صفيحة من ستة آبار وباستخدام قفاز معقم ، اضغط على المقابس في موضع الساعة 12.

50 ميكرولترا من تعليق الخلية في وسط كل منها. ضع اللوحة جيدا في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 45 دقيقة لتعزيز ارتباط الخلية بينما تحتضن اللوحة ، وتستخرج شظايا العظام مع الخلايا المتصلة باللوحة. ضع جزءا من أنسجة العظام على شمع العظام في ثلاثة آبار واضغط على كل منها لأسفل باستخدام GER ثلاثة آبار بدون عناصر تحكم في خوادم الشظايا.

بعد ذلك ، أضف ببطء خمسة ملليلتر من DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS إلى جدار كل بئر. يجب عدم إزاحة شمع العظام وشظايا العظام. ثم احتضان الثقافة لمدة 20 إلى 24 ساعة.

اليوم التالي قم بتصوير الخلايا أولا. أضف 300 ميكروغرام لكل مليلتر من لوسيفر إلى كل بئر ، ثم قم على الفور بتصوير اللوحة باستخدام منصة تصوير Ivis. تتطلب هذه التجربة تعليق خلايا سرطان الثدي مثل سابقتها.

بعد استخراج شظايا العظام ، استخدم الملقط لنقل كل جزء إلى بئر فارغ من صفيحة 24 بئرا ، ثم ماصة 50 ميكرولترا من تعليق الخلية مباشرة على كل جزء من العظام ، وانقل الصفيحة إلى حاضنة لمدة 45 دقيقة لتعزيز ارتباط الخلية. بمجرد أن تلتصق الخلايا برفق ، أضف ملليلترا إلى ملليلترين من الوسط إلى كل بئر بما يكفي لغمر جزء العظم. ثم ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 إلى 24 ساعة.

استعدادا لتصوير اللبلبل, التصوير الفلوري أو جمع خلايا النخاع لتحليلها لتصوير اللبلبل, نقل شظايا العظام إلى 24 بئر صفيحة مع ملليلتر واحد من الوسط الطازج لكل بئر. أضف 300 ميكروغرام لكل مليلتر لوسيفر إلى كل بئر واستمر كما هو موضح سابقا للفحص المجهري الفلوري. ماصة خمسة ميكرولترات من محلول وضع العلامات على ثنائي الفوسفات الفلوري في كل بئر لتسمية الشوكات العظمية لجزء العظام واحتضان اللوحة لمدة 24 ساعة أخرى.

بعد 24 ساعة ، استخدم الملقط لنقل الشظايا إلى أطباق تحتوي على وسط خال من الفينول الأحمر. ثم اعرض اللوحات باستخدام مجهر مضان تم تكوينه للتصوير عند 485 نانومتر لتوطين استعمار GFP الذي يعبر عن خلايا سرطان الثدي و 680 نانومتر. لتحديد شويكات العظام المسماة بالثنائي فوسفات لشطف حجرة نخاع العظم لتحليل أعداد الخلايا أو خصائصها.

انقل جزءا إلى مصفاة 70 ميكرون فوق أنبوب كرونيكل سعة 50 مل. ثم استخدم حقنة سعة 10 مليلتر بإبرة قياس 25 لشطف الجزء بقوة باستخدام 10 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي PBS. التعليق عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا والشفط والتخلص من الريوس supinate.

ثني حبيبات خلايا النخاع في PBS أو المحاليل الأخرى المرغوبة لكل قياس التدفق الخلوي أو فحوصات الجدوى. ابدأ بتوليد شبكة الأنسجة العظمية. ضع شظايا العظام في آبار 12.

صفيحة بئر تحتوي على 2.2 مل من DMEM 10٪ FBS لكل بئر وتترك بعض آبار التحكم بدون شظايا عظمية. استزراع الطبق لمدة 24 ساعة. ثم استنشق واستبدال الوسط واستمر في الثقافة لمدة 24 ساعة أخرى ، 48 ساعة في نقل الثقافة 0.9 مل من supinate إلى لوحة الاستقبال أثناء احتضان لوحة الاستقبال مؤقتا.

ضع إدخالات البئر في صفيحة فارغة من 24 بئر. ثم iPet 100،000 خلية سرطان الثدي في 350 ميكرولتر على كل إدراج. ثم قم بزراعة الألواح لمدة 45 دقيقة لتعزيز ارتباط الخلية بعد 45 دقيقة ، استخدم الملقط لنقل الإدخالات إلى لوحة الاستقبال.

تأكد من زاوية الإدخالات عند وضعها في جهاز الاستقبال. حسنا ، استلقيت حتى لا تتشكل الفقاعات. ثم احتضان اللوحة بإدخالات لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي.

استخدم الملقط لإزالة الإدخالات وإضافة 300 ميكروغرام لكل ملليلتر لوسيفر إلى كل منها. قم بإجراء تصوير التلألؤ البيولوجي بشكل جيد على لوحة الاستقبال للكشف عن خلايا سرطان الثدي التي هاجرت عبر الأغشية وتعلق على قاع آبار لوحة الاستقبال. أولا ، قم بتحميل لوحة الاستقبال بوسط وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة.

لبذر الإدخال. اقلبها في صندوق أنبوبي صغير فارغ بغطاء. ثم أضف 100 ، 000 خلية في 50 ميكرولتر إلى السطح السفلي الخارجي لكل غشاء إدراج.

قم بتغطية الصندوق مع ترك الغطاء متشققا واحتضان الإدخالات لمدة 45 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة. ثم استخدم الملقط لقلب ونقل الإدخالات ، وآبار لوحة الاستقبال في كل كوب إدخال عند 0.45 مل من DMEM مع 10٪ FBS. ثم أضف قطعة عظم بحجم ثلاثة ملليمترات أو حبة زجاجية إلى كل ملحق وقم بتقطيعها إلى اللوحة لمدة 20 ساعة.

في اليوم التالي ، استخدم الملقط لنقل الشظايا والخرز إلى طبق به آبار تحتوي على مليلتر من الوسط الطازج. أضف 300 ميكروغرام لكل مليلتر لوسيفر لكل بئر واستمر في التصوير الحيوي. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

تم زراعة خلايا سرطان الثدي بشكل مشترك بجوار شظايا العظام المجمدة لقياس تكاثر خلايا الثدي. أظهر التصوير الحيوي بعد 24 ساعة من الثقافة تكاثر خلايا سرطان الثدي المحسس في وجود شظايا العظام في الآبار الثلاثة العلوية مقارنة بعدم وجود شظايا العظام في الآبار الثلاثة السفلية. أظهرت نتائج التجارب باستخدام شظايا من ثلاث عينات جراحية منفصلة تكتثارا محسنا في وجود العظام مقابل غيابها.

في جميع الحالات الثلاث ، لوحظ استعمار خلايا MCF السبع F Luke EGFP الموجودة مباشرة تحت شظايا أنسجة العظام مع التصوير الحيوي بعد 24 ساعة. ارتبط انخفاض الإشارة بانخفاض كثافة البذر بعد 48 ساعة. كشفت الشظايا المصنفة مباشرة المسماة بكاشف البايفوسفونات عن استعمار خلايا سرطان الثدي الإيجابية GFP داخل مقصورات التمعدن والنخاع.

هجرة خلايا سرطان الثدي عبر غشاء الهجرة المسامي نحو زراعة أنسجة العظام ، والمواد الطافية التي شوهدت في الآبار الثلاثة الأولى قوية مقارنة بالهجرة إلى السيطرة. المتوسط يرى في الآبار الثلاثة السفلية. كما لوحظ هجرة إلى ثلاث شظايا عظمية من عينة THR معينة ، بينما لم يلاحظ أي هجرة على الخرز.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج شظايا أنسجة العظام البشرية من عينة رأس الفخذ والبدء بها في فحوصات الزراعة المشتركة لقياس سلوكيات خلايا سرطان الثدي بما في ذلك الهجرة والاستعمار والانتشار.