طرق التثقيف عظم الفخذ الإنسان إإكسبلنتس الأنسجة لدراسة سرطان الثدي الاستعمار خلية للالمتخصصة الإنتقالية

الهدف من هذا الإجراء هو دراسة تكاثر خلايا سرطان الثدي واستعمارها وهجرتها في نظام نموذجي لقطعة نسيجية من عظم بشري. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل شظايا من نسيج العظم التربيقي من عينات جراحية لرأس الفخذ وزراعتها مع خلايا سرطان الثدي التي تعبر عن لوسيفيريز والبروتين الفلوري الأخضر. ويُستخدم التصوير بالتلألؤ البيولوجي لقياس تكاثر الخلايا والتحقق من استعمار خلايا سرطان الثدي في شظايا النسيج العظمي.

يتم تصوير أنماط استعمار خلايا سرطان الثدي باستخدام المجهر الفلوري. كما يمكن غسل جزء النخاع من الشظايا لتحليله عن طريق قياس التدفق الخلوي وبواسطة فحوصات التألق والصبغ. ويُقاس هجرة خلايا سرطان الثدي نحو المزارع النسيجية والسوائل الطافية وشظايا الأنسجة العظمية في غرف هجرة Transwell باستخدام التصوير بالتلألؤ الحيوي؛ وبما أن العظام هي الموقع الأكثر شيوعاً لانتشار سرطان الثدي، فإن هذا النموذج يوفر في النهاية نافذة جديدة لدراسة خلايا سرطان الثدي داخل البيئة المجهرية لسرطان الثدي المنتشر في العظام.

تتمثل الميزة الكبيرة لهذا النموذج في توفيره وصولاً مباشراً إلى البيئة المجهرية لشظايا أنسجة العظام البشرية، مما يسمح لنا بمراقبة وتحليل سلوك خلايا سرطان الثدي بسهولة خلال تجارب الزراعة المشتركة قصيرة المدى. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أسئلة جوهرية حول الآليات الكامنة وراء انتقال سرطان الثدي إلى العظام، بهدف تحديد استراتيجيات علاجية للوقاية من هذا الانتقال وعلاجه بفعالية. ورغم أن هذا النموذج يمكن أن يقدم رؤى حول انتقال سرطان الثدي، إلا أنه يمكن استخدامه أيضاً لدراسة الأورام الخبيثة الأخرى التي تستهدف العظام، مثل سرطان البروستاتا.

يجب جمع قطع من أنسجة العظام في نقاط مختلفة خلال كل مقايسة. يبدأ ذلك بجمع ونقل عينة من الفخذ في محلول ملحي، وتجهيز محطة العمل داخل كابينة السلامة البيولوجية مع ارتداء قفاز جراحي. أمسك رأس عظمة الفخذ بيد واحدة واستخدم مبردًا جراحيًا لاستخراج العظم التربيقي.

تتراوح أحجام الشظايا بين مليمترين إلى خمسة مليمترات تقريبًا. لن تكون الملاقط مجدية في هذه الخطوة، لذا ستحتاج إلى مسبار جراحي عالي الجودة.

لهذه التجربة، قم بتحضير معلق خلايا سرطان الثدي بتركيز 100,000 خلية لكل 50 µL من وسط DMEM مضافاً إليه 10% FBS. بالإضافة إلى ذلك، قم بتحضير سدادات من شمع العظام لتحريك شظايا العظم باستخدام الأطراف المقطوعة لطرف ماصة دقيقة، ثم احفظ السدادات في طبق بتري. بعد ذلك، انقل السدادات باستخدام ملقط إلى طبق ذي ستة آبار، وباستخدام قفاز معقم، اضغط السدادات في موضع الساعة 12.

بعد ذلك، انقُل بواسطة الماصة 50 µL من معلق الخلايا إلى مركز كل بئر. ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 45 دقيقة لتعزيز التصاق الخلايا. وأثناء فترة تحضين الطبق، استخرج شظايا العظام التي تلتصق بها الخلايا بالطبق. ضع شظية من نسيج العظم على شمع العظام في ثلاثة آبار واضغط على كل منها باستخدام GER. وتعمل الآبار الثلاثة المتبقية التي لا تحتوي على شظايا كعناصر تحكم.

بعد ذلك، أضف ببطء 5 mL من وسط DMEM مضافاً إليه 10% FBS إلى جدار كل بئر. يجب الحرص على عدم تحريك شمع العظام وقطع العظام من مكانها. ثم يتم تحضين المزرعة لمدة تتراوح بين 20 إلى 24 ساعة.

في اليوم التالي، قم بتصوير الخلايا أولاً. أضف 300 micrograms per milliliter من Lucifer إلى كل بئر، ثم قم بتصوير الطبق فوراً باستخدام منصة تصوير Ivis. تتطلب هذه التجربة معلق خلايا سرطان الثدي مثل التجربة السابقة.

بعد استخراج شظايا العظام، استخدم الملقط لنقل كل شظية إلى بئر فارغ في طبق يحتوي على 24 بئراً، ثم انقل 50 µL من معلق الخلايا مباشرة فوق كل شظية عظمية، وانقل الطبق إلى الحاضنة لمدة 45 دقيقة لتعزيز التصاق الخلايا. وبمجرد التصاق الخلايا، أضف برفق من 1 إلى 2 mL من الوسط الغذائي إلى كل بئر بكمية كافية لغمر شظية العظم. بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة تتراوح من 20 إلى 24 ساعة.

تمهيداً للتصوير بجهاز Ivis، أو التصوير الفلوري، أو جمع خلايا النخاع لتحليلها من أجل التصوير بجهاز Ivis، انقل شظايا العظام إلى طبق يحتوي على 24 بئراً مع إضافة 1 mL من الوسط الغذائي الطازج لكل بئر. أضف 300 µg/mL من مادة Lucifer إلى كل بئر، ثم تابع الخطوات كما هو موصوف سابقاً في مجهر الفلورية. استخدم الماصة لإضافة 5 µL من محلول وسم البيسفوسفات الفلوري في كل بئر لوسم السويقات العظمية لشظية العظم، ثم قم بحضن الطبق لمدة 24 ساعة إضافية.

بعد مرور 24 ساعة، استخدم الملقط لنقل الشظايا إلى أطباق تحتوي على وسط خالٍ من الفينول الأحمر. ثم افحص الأطباق باستخدام مجهر فلوري مهيأ للتصوير عند 485 نانومتر لتحديد مواقع مستعمرات خلايا سرطان الثدي التي تعبر عن GFP، وعند 680 نانومتر لتحديد شوكيات العظم المسمى بالبيسفوسفات. قم بغسل حجرة نخاع العظم لتحليل أعداد الخلايا أو خصائصها.

انقل قطعة من النسيج إلى مصفاة بمسام حجمها 70 micron فوق أنبوب chronicle سعة 50 milliliter. بعد ذلك، استخدم محقنة سعة 10 milliliter مع إبرة قياس 25 gauge لغسل قطعة النسيج بقوة باستخدام 10 milliliters من PBS centrifuge. قم بطرد المعلق مركزياً عند 300 G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه.

أعد تعليق كريات خلايا النخاع في PBS أو أي محاليل أخرى مطلوبة وفقاً لتقنيات قياس التدفق الخلوي أو اختبارات الحيوية. ابدأ بتوليد قطع نسيج عظمي. ضع شظايا العظام في آبار طبق 12.

طبق آبار يحتوي على 2.2 milliliters من DMEM 10%FBS لكل بئر، مع ترك بعض آبار التحكم بدون شظايا عظمية. يتم تحضين الطبق لمدة 24 ساعة، ثم يتم سحب الوسط واستبداله بوسط جديد والاستمرار في التحضين لمدة 24 ساعة أخرى. بعد مرور 48 ساعة على نقل المزرعة، يتم نقل 0.9 milliliters من السائل الطافي إلى طبق مستقبل مع تحضين الطبق المستقبل مؤقتاً.

ضع أدوات إدراج Transwell في طبق فارغ يحتوي على 24 بئراً. بعد ذلك، قم بوضع 100,000 خلية من خلايا سرطان الثدي في 350 µL فوق كل أداة إدراج. ثم قم بحضن الأطباق لمدة 45 دقيقة لتعزيز التصاق الخلايا. بعد مرور 45 دقيقة، استخدم الملقط لنقل أدوات الإدراج إلى طبق استقبال.

تأكد من إمالة الحلقات الإدراجية عند وضعها في المستقبل. قم بالتحريك بلطف لضمان عدم تكون فقاعات. بعد ذلك، قم بتحضين الطبق الذي يحتوي على الحلقات الإدراجية لمدة 20 ساعة عند 37 degrees Celsius حتى اليوم التالي.

استخدم الملاقط لإزالة الرقاقات وأضف 300 micrograms per milliliter من مادة Lucifer إلى كل واحدة منها. قم بإجراء تصوير بالتلألؤ البيولوجي على لوحة الاستقبال للكشف عن خلايا سرطان الثدي التي هاجرت عبر الأغشية والتصقت بقاع آبار لوحة الاستقبال. أولاً، قم بتعبئة لوحة الاستقبال بالوسط الزرعي وضعها في حاضنة زراعة الأنسجة.

لبذر الإضافات، اقلبها في صندوق أنابيب مجهرية فارغ ومغلق الغطاء. ثم أضف 100,000 خلية في 50 µL إلى السطح السفلي الخارجي لغشاء كل إضافة.

قم بتغطية الصندوق مع ترك الغطاء مفتوحاً قليلاً، ثم حضن الإضافات لمدة 45 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد ذلك، استخدم الملقط لقلب ونقل الإضافات إلى آبار لوحة استقبال، بحيث يوضع في كل كوب إضافة 0.45 milliliters من وسط DMEM مع 10%FBS. ثم أضف قطعة عظمية بحجم ثلاثة مليمترات أو خرزة زجاجية إلى كل إضافة، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 20 ساعة.

في اليوم التالي، استخدم الملاقط لنقل الشظايا والخرز إلى طبق يحتوي على آبار بها 1 mL من الوسط الغذائي الطازج. أضف 300 µg/mL من Lucifer لكل بئر، ثم ابدأ بالتصوير بالتلألؤ البيولوجي. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

تمت زراعة خلايا سرطان الثديร่วม مع شظايا عظمية مثبتة لقياس تكاثر خلايا الثدي. وأظهر التصوير بالتلألؤ البيولوجي بعد 24 ساعة من الزراعة تعزيزاً في تكاثر خلايا سرطان الثدي في وجود شظايا العظم في الآبار الثلاثة العلوية مقارنة بغياب شظايا العظم في الآبار الثلاثة السفلية. وأظهرت نتائج التجارب التي استخدمت شظايا من ثلاث عينات جراحية منفصلة تعزيزاً في التكاثر في وجود العظام مقابل غيابها.

في جميع الحالات الثلاث، لوحظ استعمار خلايا MCF seven F Luke EGFP المستقرة مباشرة تحت شظايا الأنسجة العظمية باستخدام التصوير بالتلألؤ البيولوجي بعد مرور 24 ساعة. وارتبط انخفاض الإشارة بتناقص كثافة الاستزراع بعد 48 ساعة. وكشفت الشظايا المستزرعة مباشرة والموسومة بكاشف البيسفوسفونات عن استعمار خلايا سرطان الثدي الموجبة لـ GFP داخل المقصورات المعدنية والنخاعية.

كان هجرة خلايا سرطان الثدي عبر غشاء الهجرة المسامي باتجاه مزارع أنسجة العظام، والملاحظة في الآبار الثلاثة العلوية، قوية مقارنة بالهجرة في عينة الضابطة. يظهر الوسط في الآبار الثلاثة السفلية. كما لوحظت الهجرة إلى ثلاث شظايا عظمية من عينة استبدال مفصل الورك (THR) محددة، بينما لم تلاحظ أي هجرة على الخرزات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص قطع من أنسجة العظام البشرية من عينة لرأس الفخذ، وبدء استخدامها في مقايسات الزراعة المشتركة لقياس سلوكيات خلايا سرطان الثدي، بما في ذلك الهجرة والاستعمار والتكاثر.