Name: تحليل مخطط كهربية الشبكية من الاستجابة البصرية في الزرد اليرقات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: تعلم تقنية تخطيط كهربية الشبكية في يرقات سمك الزرد لدراسة وظائف المخروطات البصرية في شبكية الفقاريات. هذه الطريقة تتيح للباحثين تقييم الوظيفة البصرية في النموذج الحي بكفاءة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر أعضاء مرفق الاستزراع المائي لأسماك الزرد في جامعة نورث كارولينا على صيانة أسماك الزرد. نود أيضا أن نشكر Diagnosys، LLC على المساعدة في إعداد جهاز ERG. شكر إضافي للدكتورة بورتيا ماكوي ومختبر الدكتور بن فيلبوت للمساعدة في الأساليب الفيزيولوجية الكهربية. نود أيضا أن نشكر ليزي جريفيث على توضيحها ليرقات الزرد. تم دعم هذا العمل من قبل جوائز المعاهد الوطنية للصحة F32 EY022279 (إلى JDC) و R21 EY019758 (إلى E.R.W).

تمت الموافقة على صيانة والبروتوكولات التجريبية من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ، وتفي بجميع متطلبات مكتب المعاهد الوطنية للصحة لرعاية المختبر وجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية. 
ملاحظة: للحصول على اليرقات لتحليل ERG ، تم استخدام البروتوكولات المنشورة لتربية أسماك الزرد القياسية وصيانتها18. يتم الحصول على اليرقات من خلال التكاثر الطبيعي ويتم إيواؤها تحت دورة ضوء 14 ساعة / 10 ساعات مظلمة. تم تحسين هذا البروتوكول لليرقات بعد 5-7 أيام من الإخصاب (dpf) ، ولكن يمكن إجراؤه بشكل مثالي على الأسماك الأكبر سنا مع تعديلات طفيفة على الإجراء. هنا ، استخدم سلالة TL من يرقات الزرد من النوع البري عند 5 dpf.
فئة 1. إنتاج الماصات الدقيقة
<ol>
	<li>اسحب العديد من الماصات الدقيقة باستخدام شعيرات دموية زجاجية من البورسليكات مصقولة بالحريق مقاس 1.5 × 0.86 مم مع خيوط (درجة حرارة الانصهار، 821 درجة مئوية) ومجتذب ماصات دقيقة مشتعلة/بنية اللون P-97 مزودة بخيوط حرارية صندوقية. استخدم البرنامج لتشكيل الماصات الدقيقة الموضحة في الجدول 1.</li>
	<li>افحص كل ماصة دقيقة تحت المجهر باستخدام مسطرة graticule مناسبة للتأكد من أن الأطراف يبلغ قطرها 10-15 ميكرومتر ولها فتحة طرف ناعمة (أي بدون حواف خشنة).</li>
	<li>قم بتخزين الماصات الدقيقة بعناية لمنع تلف الأطراف والتعرض للغبار. تشمل خيارات التخزين أطباق بتري مع شريط مختبر أو صناديق مبطنة بالرغوة أو حاويات تخزين الماصات الدقيقة المتوفرة تجاريا. 
	ملاحظة: يمكن استخدام ساحبات الماصات الدقيقة والشعيرات الدموية الزجاجية الأخرى طالما تم تحقيق القطر الصحيح للماصة الدقيقة وطرف عالي الجودة.</li>
</ol>
<border الجدول = "0" cellpadding = "0" cellpacing = "0" >
	<tbody>
		<tr>
			<td>ضغط</td>
			<td>حرارة</td>
			<td>سحب</td>
			<td>السرعه</td>
			<td>الوقت</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500</td> جنيه
			<td>560</td> ريال
			<td>-</td>
			<td>30</td>
			<td>200</td> ريال
		</tr>
		<tr>
			<td>500</td> جنيه
			<td>450</td> ريال
			<td>-</td>
			<td>30</td>
			<td>200</td> ريال
		</tr>
		<tr>
			<td>500</td> جنيه
			<td>410</td>
			<td>55</td>
			<td>40</td>
			<td>200</td> ريال
		</tr>
	</tbody>
</table>
الجدول 1: برنامج لإنتاج الماصات الدقيقة باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة P-97 Flaming/brown المزود بخيوط حرارية صندوقية. تصنع الماصات الدقيقة باستخدام شعيرات دموية زجاجية من البورسليكات مصقولة بالحريق مقاس 1.5 × 1.0 مم2 (القطر الخارجي حسب القطر الداخلي) مع خيوط (درجة حرارة الانصهار، 821 درجة مئوية).
2. إعداد المخزن المؤقت
<ol>
	<li>استخدم المخزن المؤقت19 للسمكة الذهبية المؤكسجة المفلترة في الشعيرات الدموية الكهربية الدقيقة ولتشبع إسفنجة كحول البولي فينيل (PVA) التي توضع عليها اليرقات للتجارب. بدلا من ذلك ، استخدم وسائط الجنين E3 أو محلول الملح المتوازن من Hank.</li>
	<li>قم بإعداد محلول Ringer للسمكة الذهبية 10x كما هو موضح في الجدول 2. اضبط على درجة الحموضة 7.8 ، وقم بتعقيمها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين مخزون 10x عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>قم بإنشاء حل عملي في يوم التجربة عن طريق تخفيف محلول Ringer 10x إلى 1x بالماء المقطر منزوع الأيونات. قم بالتصفية باستخدام نظام تصفية 0.22 ميكرومتر. أكسجة عن طريق الفقاعات مع 95٪ O2/5٪ غاز ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 10 دقائق. قم بالغطاء بإحكام بعد ذلك للتأكد من بقاء المحلول مؤكسجا.</li>
</ol>
<border الجدول = "0" cellpadding = "0" cellpacing = "0" >
	<tbody>
		<tr>
			<td>كلوريد الصوديوم</td>
			<td>1.25 م</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كيه سي إل</td>
			<td>26 ملم</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كلوريدالهواء 2</td>
			<td>25 ملم</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>مغنكلوريد2</td>
			<td>10 ملم</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>الجلوكوز</td>
			<td>100 ملم</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>هيبس</td>
			<td>100 ملم</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
الجدول 2: تحضير محلول Ringer للسمكة الذهبية 10x.
3. منصة مخطط كهربية الشبكية
<ol>
	<li>قم بإجراء تجارب ERG على طاولة مضادة للاهتزاز داخل قفص فاراداي لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. قم بتوصيل منصة فولاذية مخصصة بالطاولة المضادة للاهتزاز باستخدام الصواميل السداسية. ضع منصة بلاستيكية متحركة مع قاع ممتص للصدمات من بوليمر يوريثان لزج مرن على الطاولة أسفل مصدر الضوء.</li>
	<li>ضع الكاميرا بحامل ممغنط موجه لأسفل على المنصة البلاستيكية المتحركة. ضع المعالج الدقيق (الذي سيحمل القطب الصغير للتسجيل) بحامل ممغنط ثان على يمين المنصة البلاستيكية المتحركة. تأكد من عدم إزعاج الكاميرا وجهاز المعالجة الدقيقة من خلال حركة المعدات الأخرى وعدم إزعاجهما للإضاءة من مصدر الضوء.</li>
	<li>قم بتوصيل الكاميرا بشاشة فيديو ووضعها لعرض عين اليرقة لوضع القطب في الموضع المناسب.</li>
	<li>تأكد من تأريض الإعداد بشكل صحيح بالأسلاك النحاسية. للتحقق من الضوضاء، ضع القطب المرجعي وطرف القطب الصغير للتسجيل في طبق بتري مقاس 35 مم مملوء بمحلول رينجر. تحقق من مستويات الضوضاء الكهربائية للإعداد باستخدام راسم الذبذبات أو ميزة مدمجة في جهاز EG. يجب ألا تزيد مستويات الضوضاء عن ±10 ميكرو فولت من خط الأساس.</li>
</ol>
فئة < ص = "jove_title" >4. إعداد الإسفنج
<ol>
	<li>قم بقص مستطيل صغير من إسفنجة PVA الجافة التي تتناسب بشكل مريح مع طبق بتري مقاس 35 مم. يجب ألا يكون سمك الإسفنجة أكبر من عمق الطبق. استخدم سكينا متعدد الاستخدامات بشفرة حلاقة نظيفة للقطع.</li>
	<li>قم بعمل قطع إضافي في الإسفنجة لاستيعاب القطب المرجعي (إما قطع ضحل بالطول في الجزء السفلي من الإسفنج أو فراشة مقطوعة عموديا من خلال أحد الأطراف الأصغر).</li>
	<li>استخدم علامة مقاومة كيميائيا لتمييز نقطة صغيرة على الإسفنجة (حيث سيتم وضع اليرقة) يمكن استخدامها لوضع الكاميرا.</li>
	<li>انقعي إسفنجة PVA في محلول Ringer حتى تشبع. قم بإزالته ووصله بسرعة على منشفة ورقية 2-3 مرات. ضع الإسفنجة في طبق بتري نظيف مقاس 35 مم.</li>
	<li>ضع طبق بتري الذي يحتوي على الإسفنجة على المنصة البلاستيكية بحيث يمكن تصور العلامة بواسطة الكاميرا.</li>
</ol>
فئة 5. تحضير القطب الكهربائي
ملاحظة: يتكون إعداد الزرد من قطب مرجعي ملامس لإسفنجة PVA المشبعة بمحلول Ringer وقطب تسجيل ملامس للقرنية. يتكون القطب المرجعي من حبيبات Ag / AgCl. قطب التسجيل عبارة عن ماصة زجاجية مسحوبة مملوءة بمحلول Ringer ويتم تثبيتها بواسطة حامل قطب كهربائي صغير يحتوي على سلك Ag.
<ol>
	<li>كلوريد الأقطاب الكهربائية عن طريق نقعها في 6-9٪ هيبوكلوريت الصوديوم (المبيض) لمدة 5 دقائق (سلك القطب الصغير التسجيل) أو 15 دقيقة (القطب المرجعي). يجف في الهواء على Kimwipe لمدة 5 دقائق.
	<ol>
		<li>اعتمادا على نمط القطع الذي تم إجراؤه في الخطوة 4.2 ، ضع حبيبات Ag / AgCl للقطب المرجعي في (لقطع الفراشة العمودية) أو أسفل (للقطع الضحل بالطول في الأسفل) الإسفنجة. قم بتوصيل سلك القطب المرجعي بنظام التسجيل.</li>
		<li>بدلا من ذلك ، إذا كان إعداد ERG يحتوي على قيود على مساحة أو كانت هناك قطع أثرية كهروضوئية قوية بشكل خاص من قطب Ag / AgCl ، فقم بتوصيل القطب المرجعي بالإسفنج عبر جسر ملح أجار لتحريك القطب الكهربائي خارج مسار الضوء.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>قم بتوصيل ~ 40 سم من الأنابيب ذات الحجم المناسب بحقنة قفل غير Luer سعة 5 مل. املأ المحقنة بمحلول رينجر. عادة ما يتم شحن حاملي الأقطاب الكهربائية الدقيقة التي تمتلك منافذ ضغط مع محولات لاستيعاب الأنابيب بأقطار داخلية 1/16 "أو 3/32" أو 1/8 "أو 5/32".</li>
	<li>املأ حقنة قفل غير Luer سعة 1 مل بمحلول Ringer ، وباستخدام Micro-fil ، املأ حامل القطب الكهربائي الدقيق بعناية. منع تكوين الفقاعات.</li>
	<li>قم بتوصيل المحقنة سعة 5 مل بمنفذ الضغط الخاص بحامل القطب الكهربائي الدقيق مع الأنبوب واستخدمه للتأكد من أن حامل القطب الكهربائي الدقيق مليء بمحلول Ringer. باستخدام حقنة Micro-fil و 1 مل مملوءة بمحلول Ringer ، املأ زجاج الماصة الدقيقة من الطرف وتأكد من عدم وجود فقاعات.</li>
	<li>قم بتوصيل الماصة الدقيقة الزجاجية بحامل القطب الكهربائي الدقيق، مع الحرص على إبقاء سلك القطب مستقيما. بمجرد تثبيتها ، استخدم المحقنة سعة 5 مل لإجبار محلول Ringer بعناية عبر القطب الكهربائي الدقيق حتى تظهر كمية صغيرة من المحلول على الحافة. سيؤدي الضغط العرضي على المحقنة (عند عدم تطبيقه على القرنية) إلى منع تكوين فقاعات الهواء ، وكذلك الانسدادات بسبب تراكم الغبار أو الملح ، في طرف الماصة الدقيقة.
	<ol>
		<li>إذا خرج المحلول على شكل تيار ، فاستبدل الماصة الدقيقة الزجاجية ، لأن فتحة الطرف كبيرة جدا أو تالفة.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ضع القطب الكهربائي الدقيق للتسجيل بعناية في جهاز المعالجة الدقيقة وقم بتوصيل السلك بنظام التسجيل.</li>
</ol>
فئة 6. تحليل مخطط كهربية الشبكية
ملاحظة: نظرا للهيمنة المخروطية لشبكية العين ، يمكن الحصول على نتائج ERG عالية الجودة عند إجراء الاستعدادات للتسجيل تحت مستويات منخفضة من الضوء الأبيض غير المباشر (<1 لوكس) أو بفترات قصيرة (<1 دقيقة) من ضوء العمل عالي الكثافة (≤250 لوكس). لا تزال هناك حاجة إلى فترة قصيرة من التكيف المظلم قبل التسجيل (انظر الخطوة 6.7). ومع ذلك ، يمكن إجراء التجارب تحت الضوء الأحمر الخافت أو الأشعة تحت الحمراء باستخدام كاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء. أجريت جميع التجارب في مياه نظام معقمة بالترشيح (0.22 ميكرومتر) من مرفق الاستزراع المائي لأسماك الزرد التابعة لجامعة نورث كارولينا ولكن يمكن استخدام وسائط جنينية بديلة.
<ol>
	<li>قطع مربعات المناشف الورقية بقياس حوالي 1 سم2.</li>
	<li>في حالة قياس إمكانات مستقبلات الكتلة المخروطية المعزولة ، احتضان 3-5 يرقات في ماء النظام مع 500 ميكرومتر (±) -2-أمينو-4-فوسفونوبوتيريك حمض (APB) لمدة 5 دقائق 
	ملاحظة: في حين أن APB عبارة عن مزيج عرقي من الأشكال النشطة (L) وغير النشطة (R) من AP4 ، إلا أنها فعالة مثل L-AP4 وأقل تكلفة.</li>
	<li>قم بتخدير 3-5 يرقات في ماء النظام باستخدام 0.02٪ (وزن / حجم) تريكايين حتى لا يستجيب ، حوالي 1-2 دقيقة.</li>
	<li>استخدم ماصة باستور ومضخة ماصة لنقل اليرقات الفردية بعناية إلى مربعات المناشف الورقية تحت مجسم تشريح باستخدام الحد الأدنى من الإضاءة (≤250 لوكس لمدة <1 دقيقة). تحقق من موضع كل يرقة واختر مرشحا يكون الجانب الظهري لأعلى مع عين غير مسدودة.
	<ol>
		<li>للتسجيلات الممتدة (>30 دقيقة) ، حافظ على رطوبة اليرقة عن طريق تزجيج الجسم حتى الرأس ولكن ليس بما في ذلك ميثيل السليلوز بنسبة 3٪ باستخدام فرشاة شعر الإبل الدقيقة.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>باستخدام الملقط ، انقل مربع المناديل الورقية مع اليرقة إلى إسفنجة PVA الرطبة.
	<ol>
		<li>للتسجيلات الممتدة (>30 دقيقة) ، ضع تيارا مستمرا من غاز O2 المشبع بالماء بنسبة 100٪ على اليرقة عن طريق فقاعات الغاز عبر حجر هوائي في قارورة ذراع جانبية تحتوي على ماء مقطر. ضع الأنبوب الخارج من الذراع الجانبية للقارورة التي تنقل الأكسجين المرطب بالقرب من رأس اليرقة. 
		ملاحظة: الخطوة 6.4.1 والخطوة 6.5.1 ستعمل على إطالة عمر السمكة16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تحت الحد الأدنى من الإضاءة ، استخدم الملاعب الدقيقة والكاميرا لوضع طرف القطب الكهربائي الدقيق عند نقطة المنتصف بين طرفي الأنف والذيلية للعين واضغط برفق على الحد الظهري للقرنية. 
	ملاحظة: يمكن أن يؤدي وضع طرف القطب الخاطئ في المناطق البعيدة من القرنية إلى أشكال موجات ERG ذات قطبية عكسية.</li>
	<li>اسمح لليرقة بالتكيف مع الظلام لمدة 5-10 دقائق.</li>
	<li>سجل استجابات فلاش الاختبار للضوء المقدم من مصدر ضوء LED أو محفز بصري باستخدام معدات التحفيز والتسجيل المتاحة. اضبط معلمات البروتوكول مثل شدة الفلاش وطول الفلاش ولون الفلاش وكثافة الخلفية واللون وإعدادات المرشح لتناسب التجربة.</li>
	<li>عند الانتهاء من التجربة ، قم بالقتل الرحيم لليرقات وفقا لإرشادات AVMA / IACUC.</li>
</ol>

<ol><li>Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDowling%2C+JE+%22The+retina%3A+an+approachable+part+of+the+brain%22">The retina: an approachable part of the brain</a>. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).</li>
<li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li>
<li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeckenlively%2C+JR+%22Principles+and+Practice+of+Clinical+Electrophysiology+of+Vision%22">Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision</a>. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).</li>
<li>Perlman, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlman%2C+I+%22Webvision%3A+The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System%22">Webvision: The Organization of the Retina and Visual System</a>. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22ProgRetin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
<li>Doerre, G., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+photoreceptor+cell+development+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina.</a> Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+stimulates+a+transducin-independent+increase+of+cytoplasmic+Ca2%2B+and+suppression+of+current+in+cones+from+the+zebrafish+mutant+nof%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof.</a> J Neurosci. 23, 470-480 (2003).</li>
<li>Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cone-specific+kinase+GRK7+in+larval+zebrafish+leads+to+impaired+cone+response+recovery+and+delayed+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation.</a> Neuron. 47, 231-242 (2005).</li>
<li>Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+visual+system+development%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye.</a> Genes Dev. 21, 367-378 (2007).</li>
<li>Branchek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+photoreceptors+in+the+zebrafish%2C+brachydaniorerio.+II.+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function.</a> J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).</li>
<li>Schmitt, E. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+retinal+development+in+the+zebrafish%2C+Daniorerio%3A+light+and+electron+microscopic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses.</a> J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+contributions+to+the+electroretinogram+of+the+dark-adapted+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish.</a> Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).</li>
<li>Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+bipolar+cell+input+mechanisms+in+giant+danio%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Electroretinographic+analysis.+J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio.</a> I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).</li>
<li>Nelson, R. F., Singla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+model+for+signal+elements+isolated+from+zebrafish+photopicelectroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram.</a> Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).</li>
<li>Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EML1+%28CNG-modulin%29+controls+light+sensitivity+in+darkness+and+under+continuous+illumination+in+zebrafish+retinal+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors.</a> J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).</li>
<li>Gurevich, L., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+waveforms+of+the+ON+bipolar+neuron+and+the+b-wave+of+the+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram.</a> Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Daniorerio%29%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio)</a>. , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).</li>
<li>Kim, D. Y., Jung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+contributions+to+the+goldfish+electroretinogram+at+the+photopic+illumination+level%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+PhysiolPharmacol%22%5BJournal%5D)">Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level.</a> Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal mutants.</a> Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+colour+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 536-555 (1966).</li>
<li>Naka, K. I., Rushton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-potentials+from+luminosity+units+in+the+retina+of+fish+%28Cyprinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae).</a> J Physiol. 185, 587-599 (1966).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatlAcadSci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).</li>
<li>Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroretinogram+%28ERG%29+Measurements+in+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganzfeld+ERG+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ganzfeld ERG in zebrafish larvae.</a> Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).</li>
<li>Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lazy+eyes+zebrafish+mutation+affects+M%C3%BCller+glial+cells%2C+compromising+photoreceptor+function+and+causing+partial+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness.</a> J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).</li>
<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+genetics%22%5BJournal%5D)">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).</li>
</ol>

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

في هذا البروتوكول ، تم تفصيل إجراء بسيط لتسجيلات ERG لأسماك الزرد اليرقات. يسمح هذا الإجراء بفحص سريع وشامل للوظيفة البصرية. هناك العديد من الخطوات الحاسمة طوال الإجراء التي يجب وضعها في الاعتبار. يجب أن تكون يرقات الزرد صحية قبل التجربة لمنع الموت أثناء العلاجات الدوائية المحتملة وضمان سبل العيش لفترات طويلة أثناء تسجيلات ERG. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن تكون اليرقات المستخدمة في التجارب متطابقة بشكل وثيق مع العمر. ويرجع ذلك إلى التطور السريع لشبكية العين (أي التطور التفاضلي للأنواع الفرعية المخروطية) وكذلك ...

مخطط كهربية الشبكية (ERG) هو طريقة فيزيولوجية كهربية غير جراحية تم استخدامها على نطاق واسع في العيادة لتحديد وظيفة شبكية العين في البشر. يتم قياس النشاط الكهربائي استجابة لمحفز الضوء عن طريق وضع أقطاب تسجيل على السطح الخارجي للقرنية. تحدد خصائص نموذج التحفيز وشكل موجة الاستجابة الخلايا العصبية الشبكية التي تساهم في الاستجابة. تم تكييف هذه الطريقة للاستخدام مع عدد من النماذج الحيوانية بما في ذلك الفئران وأسماك الزرد. تتكون استجابة ERG النموذجية للفقاريات من أربعة مكونات رئيسية: الموجة A ، وهي إمكانات سلبية للقرنية مشتقة من نشاط الخلية المستقبلة للضوء. الموجة B ، وهي إمكانات إيجابية للقرنية مشتقة من الخلايا ثنائية القطب ON ؛ الموجة D ، وهي إمكانات إيجابية للقرنية تفسر على أنها نشاط الخلايا ثنائية القطب OFF ؛ والموجة C ، التي تحدث بعد عدة ثوان من الموجة b وتعكس النشاط في Müller glia وظهارة صبغة الشبكية1-4. مراجع إضافية لفهم تاريخ ومبادئ تحليل ERG في البشر النموذجية هي الكتاب المدرسي عبر الإنترنت ، Webvision ، من جامعة يوتا ونصوص مثل مبادئ وممارسات الفيزيولوجيا الكهربية السريرية للرؤية4،5.
 دانيوريريو (الزرد) مفضل منذ فترة طويلة كنموذج لنمو الفقاريات ، نظرا لنضجه السريع وشفافيته ، مما يسمح بالتحليل المورفولوجي غير الغازي لأنظمة الأعضاء ، والمقايسات السلوكية والشاشات الجينية الأمامية والعكسية (للمراجعة ، انظر Fadool and Dowling6). يرقات الزرد قابلة للعلاج الجيني والدوائي ، والتي ، عندما تقترن بخصوبتها العالية ، تجعلها نموذجا حيوانيا ممتازا للتحليلات البيولوجية عالية الإنتاجية. النسبة الأعلى من المخاريط إلى القضبان في يرقات الزرد - حوالي 1: 1 مقارنة بالفئران (~ 3٪ مخاريط) - تجعلها مفيدة بشكل خاص لدراسة وظيفة المخروط7-9.
 في شبكية الفقاريات ، تتطور المخاريط قبل القضبان10. ومن المثير للاهتمام أن مخاريط أسماك الزرد تعمل في وقت مبكر يصل إلى 4 dpf ، مما يسمح بإجراء تحليل فيزيولوجي كهربي انتقائي للمخاريط في تلك المرحلة6،11،12. في المقابل ، تظهر استجابات ERG في القضبان بين 11 و 21 dpf13. لذلك ، تعمل يرقات الزرد عند 4-7 dpf وظيفيا كشبكية مخروطية بالكامل. ومع ذلك ، فإن استجابة ERG الضوئية الأصلية ل 4-7 dpf تهيمن عليها الموجة b. تطبيق العوامل الدوائية ، مثل حمض L- (+) -2-amino-4-phosphono-butyric (L-AP4) ، ناهض لمستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluR6) التي تعبر عنها الخلايا ثنائية القطب ON ، يمنع بشكل فعال توليد الموجة b ويكشف عن إمكانات مستقبلات الكتلة المخروطية المعزولة ، ("الموجة A") 14-17.
 نصف هنا طريقة بسيطة وموثوقة لتحليل ERG باستخدام معدات ERG المتاحة تجاريا والمصممة للاستخدام مع الفئران التي تم تكييفها للاستخدام مع يرقات أسماك الزرد. يمكن استخدام هذا النظام على يرقات الزرد ذات الخلفيات الجينية المختلفة ، وكذلك تلك المعالجة بالعوامل الدوائية ، لمساعدة الباحثين في تحديد مسارات الإشارات التي تساهم في الحساسية البصرية والتكيف مع الضوء16. ستوجه الإجراءات التجريبية الموضحة في هذا البروتوكول الباحثين في استخدام تحليل ERG للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية المتعلقة بالرؤية ، وإثبات بناء إعداد ERG مرن.

<table><tbody><tr><td>قفص فاراداي</td><td>80/20 Inc</td><td></td> مخصص <td>الألومنيوم المصمم خصيصا "مجموعة نصب الصناعية" لإطار القفص</td></tr><tr><td>PVA الإسفنج</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>يوفر منصة ناعمة ورطبة لوضع يرقات الزرد</td></tr><tr><td>150 مل أنظمة التصفية المعقمة</td><td>حلول الترشيح 431154 Corning</td><td></td><td>لمنع المفصليات الصغيرة من منع الماصات الدقيقة</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys، LLC</td><td>الاتصال</td><td>بنظام الفيزيولوجيا الكهربية المعياري القادر على توليد محفزات بصرية لأي محفز وتسجيل رقمي وتحليل الاستجابات باستخدام برنامج اختصاصي ، مزيد من المعلومات في http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys، LLC</td><td>contact</td><td>Light Stimulator مع RGB LED ومصادر ضوء زينون ل Ganzfeld ERG ، مزيد من المعلومات في http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>إمساك ووضع القطب الكهربائي الدقيق للتسجيل</td></tr><tr><td>حامل الحلقة المغناطيسية</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>إمساك وتحديد موضع الكاميرا والقطب المرجعي</td></tr><tr><td>امتدادات الرصاص</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>كابلات الرصاص الاحتياطية من الإناث إلى الذكور 1.5 مم لتوصيل الأقطاب</td></tr><tr><td>الكهربائية دبوس ذكر بأنثى تقنيات محول SAFELEAD</td><td>Grass</td><td>DF-215/10</td><td>توصيل دبابيس 2 مم ب 1.5 دبابيس من اللوح</td></tr><tr><td>الأمامي إطار شاشة النافذة (معدني) وشريحة</td><td>Lowes أو Home Depot</td><td>مختلفة</td><td>لربط شبكة نحاسية بإطار قفص فاراداي</td></tr> مرشحات <tr><td>Steriflip 50 مل</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>حلول الترشيح لمنع المفصليات الصغيرة من حجب الماصات الدقيقة محول</td></tr><tr><td>BNC</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>توصيل الكاميرا بكابل BNC</td></tr><tr><td>كابل BNC</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>توصيل الكاميرا بمحول الفيديو</td></tr><tr><td>عدسة الكاميرا</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>تصور موضع القطب الصغير للتسجيل على قرنية اليرقات</td></tr><tr><td>مقرنة الكاميرا</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>تصور موضع القطب الصغير للتسجيل على القرنية</td></tr><tr><td>Luna BNC إلى VGA + HDMI</td><td>Converter Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC إلى محول VGA يسمح لصورة الكاميرا بالعرض على شاشة الكمبيوتر</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 ناهض ، يحظر الموجة b مما يسمح بتحليل مستقبلات كتلة المخروط المعزول</td></tr><tr><td>، زجاج البورسليكات</td><td>المعزول Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>زجاج البورسليكات المصقول بالنار (درجة حرارة القياس = 821 درجة ؛ ج) مع خيوط وأبعاد 1.5 مم × 0.86 مم (القطر الخارجي بالقطر الداخلي) &nbsp ؛</td></tr><tr><td>P97 مجتذب مشتعل / براون</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>لسحب الماصات الدقيقة الزجاجية</td></tr><tr><td>ورقة السوربوتان</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>بوليمر اليوريثان اللزج الاصطناعي ، الموضوعة تحت حوامل العزل السلبي ومنصة ERG لامتصاص الصدمات ومنع الانزلاق ، يمكن قطعها حسب الحجم</td></tr><tr><td>اللوح</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>لوحة عزل الاهتزاز لمحفز ERG وعينة</td></tr> <tr><td>أسماك الزردحوامل العزل السلبي</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>يوفر عزل الاهتزاز للوح التجارب</td></tr><tr><td>شبكة نحاسية</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>لخط مضخة ماصة قفص فاراداي</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>تستخدم مع ماصات باستور لنقل يرقات سمك الزرد بعناية</td></tr><tr><td>ماصات باستور</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td>تستخدم مع مضخة الماصة لنقل يرقات سمك الزرد بعناية</td></tr><tr><td>الكاميرا</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>تصور وضع القطب الصغير للتسجيل على قرنية اليرقات</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td>Western <td>Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>مخدر من الدرجة الصيدلانية ،</td></tr> <tr><td>حامل قطب كهربائي صغير Micro-fil</td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>وحامل قطب كهربائي صغير من الزجاج الكهربائي الصغير</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>يحمل قطبا كهربائيا صغيرا زجاجيا ، ويتصل بمعدات ERG</td></tr><tr><td>القطب المرجعي</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>اقطع بعناية السنتيمتر الأخير من الغلاف لتصريف المنحل بالكهرباء وفضح قطب الحبيبات Ag / AgCl الملبد</td></tr><tr><td>القطب المرجعي (بديل)</td> <td>WPI</td><td>EP1</td><td>بديل ل DRIREF-5SH. قطب Ag / AgCl الذي يجب أن يكون سلكيا / ملحوما بتوصيل الرصاص</td></tr><tr><td>كابل منخفض الضوضاء لحامل القطب الكهربائي</td><td>الدقيق WPI</td><td>13620</td><td>توصيل حامل microelctrode للتسجيل بالمحول / اللوح الأمامي</td></tr></tbody></table>

تحليل مخطط كهربية الشبكية من الاستجابة البصرية في الزرد اليرقات

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

في مخطط كهربية الشبكية (أرج) هي طريقة الكهربية موسع لتحديد وظيفة الشبكية. من خلال وضع إلكترود على سطح القرنية، ولدت النشاط الكهربائي في استجابة للضوء يمكن قياسها واستخدامها لتقييم نشاط الخلايا الشبكية في الجسم الحي. توضح هذه المخطوطة استخدام أرج لقياس وظيفة البصرية في الزرد. منذ فترة طويلة تستخدم الزرد كنموذج للتنمية الفقارية بسبب سهولة قمع الجينات التي أليغنوكليوتيد] morpholino والتلاعب الدوائي. في 5-10 إدارة الشرطة الاتحادية، والأقماع فقط وظيفية في شبكية العين اليرقات. ولذلك، فإن الزرد، على عكس الحيوانات الأخرى، هو نظام نموذج قوي لدراسة مخروط وظيفة البصرية في الجسم الحي. يستخدم هذا البروتوكول التخدير القياسية، والمجهرية والبروتوكولات stereomicroscopy التي هي مشتركة في المختبرات التي تقوم بإجراء البحوث الزرد. الأساليب المذكورة الاستفادة من معيار الكهربية مكافئuipment وكاميرا الإضاءة الخافتة للاسترشاد بها في وضع تسجيل مسرى مكروي على القرنية اليرقات. وأخيرا، علينا أن نظهر كيف أن يتوفر تجاريا أرج مشجعا / مسجل مصممة أصلا للاستخدام مع الفئران يمكن بسهولة أن تتكيف للاستخدام مع الزرد. أرج من الزرد اليرقات يوفر وسيلة ممتازة لمعايرة مخروط وظيفة البصرية في الحيوانات التي تم تعديلها من قبل morpholino الحقن قليل النوكليوتيد وكذلك أحدث التقنيات الهندسية الجينوم مثل الزنك فنجر Nucleases (ZFNs)، النسخ المنشط على غرار المستجيب Nucleases (TALENs)، و تتجمع بانتظام Interspaced قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) / Cas9، والتي زادت بشكل كبير من كفاءة وفعالية استهداف الجينات في الزرد. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نستفيد من قدرة وكلاء الدوائية لاختراق اليرقات الزرد لتقييم المكونات الجزيئية التي تساهم في photoresponse. ويعرض هذا البروتوكول الإعداد التي يمكن تعديلها واستخدامها من قبل الباحثينمع أهداف التجريبية المختلفة.

عادةً ما يتم تسجيل مخططات كهربية الشبكية (ERGs) من يرقات سمك الزيبرا في اليوم الخامس بعد الإخصاب (5 dpf)، نظرًا لأن العديد من الدراسات نشرت تسجيلات ERG في هذه المرحلة9,16,20. تم قياس استجابات اليرقات في ظروف التكيف مع الظلام دون إضاءة خلفية باستخدام منبه من ضوء LED الأبيض لمدة 20 msec. استخدمنا نظام ERG متاحًا تجاريًا يتكون من محفز ضوئي من نوع Ganzfeld ووحدة تحكم/تسجيل حاسوبية. يستخدم المحفز نظام تعديل عرض النبضة (PWM) مملوكًا ومحكم التحكم للتحكم في نصوع كل من الخلفية ومنبه الومضات. سُجلت الاستجابات...

نقدم طريقة لتحليل تخطيط كهربية الشبكية (ERG) ليرقات الزرد باستخدام تقنيات المعالجة الدقيقة وتخطيط الشبكية الكهربائية. هذه طريقة بسيطة ومباشرة لفحص الوظيفة البصرية ليرقات الزرد في الجسم الحي.

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الخطوات اللازمة لإجراء التحليل الكهربائي البياني على يرقات سمك الزيبرا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع الماصات الزجاجية الدقيقة ذات الشكل والحجم المناسبين. وتتمثل الخطوة الثانية في إعداد المعدات الضرورية للتجربة بدقة، مثل أقطاب المرجع والتسجيل.بعد ذلك، يتم تخدير يرقة سمكة الزبرا وتوجيهها بشكل صحيح بالنسبة لمعدات التحفيز والتسجيل. والخطوة النهائية هي وضع القطب الكهربائي الزجاجي الدقيق بشكل صحيح على قرنية يرقة سمكة الزبرا. وفي النهاية، يرقة سمكة الزبرا.يُعد تحليل تخطيط كهربية الشبكية (ERG) مفيداً لاستقصاء الوظيفة البصرية للمخاريط في شبكية الفقاريات التي تحتوي على مخاريط فقط في الجسم الحي. وتعتبر هذه الطريقة مفيدة جداً للإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علوم الرؤية، مثل تحديد مسارات الإشارات التي تساهم في الحساسية البصرية والتكيف الضوئي في المخاريط. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن التموضع الصحيح للمصعد الكهربائي الدقيق (micro electrode) للتسجيل على العينة يصعب تعلمه بسبب صغر حجم عين يرقات سمك الزيبرا.لبدء هذا الإجراء، اسحب عدة ماصات دقيقة باستخدام شعيرات زجاجية من البوروسيليكات المصقولة بالنار مع فتيلة. افحص كل ماصة دقيقة تحت المجهر باستخدام مسطرة مدرجة مناسبة للتأكد من أن قطر الأطراف يتراوح بين 10 إلى 15 ميكرومتر وأن مظهرها متجانس. قم بتحضير محلول عمل في يوم التجربة عن طريق تخفيف محلول رينجر 10 x إلى 1 x.قم بتعقيم المحلول باستخدام مرشح مياه مقطرة منزوعة الأيونات لضمان عدم سد الجسيمات لطرف الماصة الدقيقة. ثم قم بتهوية المحلول بأكسجين بنسبة 95% وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5% لمدة 10 دقائق. أغلق المحلول بإحكام بعد ذلك لضمان بقائه مؤكسجاً.ضع الآن منصة بلاستيكية متحركة ذات قاعدة ممتصة للصدمات من بوليمر اليوريثان لزج المرونة على طاولة مضادة للاهتزاز تحت مصدر الضوء. بعد ذلك، قم بوضع الكاميرا باستخدام حامل ممغنط ووجهها نحو المنصة البلاستيكية المتحركة. ثم ضع الميكرو-مناور الخاص بالميكرو-قطب الكهربائي للتسجيل على حامل ممغنط ثانٍ.تأكد من عدم تعرض الكاميرا والمتحكم الدقيق (micro manipulator) للاضطراب بسبب حركة المعدات الأخرى، وعدم حجب الإضاءة القادمة من مصدر الضوء. بعد ذلك، قم بتوصيل الكاميرا بشاشة فيديو ووجهها نحو المنصة. تأكد من تأريض التجهيزات بشكل صحيح باستخدام سلك نحاسي.في هذه الخطوة، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لقص مستطيل صغير من إسفنج PVA الجاف بحيث يتناسب تماماً مع طبق بتري بقطر 35 مليمتر. قم بإجراء قطع إضافي في الإسفنج لإتاحة مكان للقطب المرجعي. ثم استخدم قلماً مقاوماً للمواد الكيميائية لوضع نقطة صغيرة على الإسفنج في الموضع الذي ستوضع فيه اليرقة.بعد ذلك، انقع إسفنجة PVA في محلول رينجر حتى تتشبع. أخرجها وجففها بسرعة باستخدام منديل ورقي مرتين إلى ثلاث مرات قبل وضعها في طبق بتري نظيف بقطر 35 مليمتر. لاحقاً، ضع طبق بتري الذي يحتوي على الإسفنجة على منصة بلاستيكية بحيث يمكن للكاميرا رؤية العلامة.بعد ذلك، قم بعملية الكلورة للأقطاب عن طريق غمرها في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز يتراوح بين 6 إلى 9%. ثم اتركها لتجف في الهواء على منديل Kim لمدة خمس دقائق. ضع حبيبة الفضة/كلوريد الفضة الخاصة بالقطب المرجعي داخل أو تحت الإسفنجة بناءً على نمط القطع الذي تم إجراؤه، ثم قم بتوصيل سلك القطب المرجعي بنظام التسجيل.بعد ذلك، قم بتوصيل حوالي 40 سنتيمتر من الأنابيب بمحقنة سعة خمسة ملليلتر غير مزودة بقفل Luer، واملأ المحقنة بمحلول رينجر. بعد ذلك، املأ محقنة سعة ملليلتر واحد غير مزودة بقفل Lure بمحلول رينجر. وباستخدام أداة التعبئة الدقيقة (microfill)، املأ حامل القطب الكهربائي الدقيق بعناية مع منع تكون الفقاعات.ثم قم بتوصيل محقنة سعة خمسة ملليلتر بمنفذ الضغط في حامل القطب الكهربائي الدقيق باستخدام أنابيب microfill ومحقنة سعة ملليلتر واحد مملوءة بمحلول رينجر. املأ الماصة الزجاجية الدقيقة من الطرف وتأكد من عدم وجود فقاعات. بعد ذلك، قم بتثبيت الماصة الزجاجية الدقيقة في حامل القطب الكهربائي الدقيق مع الحرص على إبقاء سلك القطب مستقيماً.بمجرد التثبيت، استخدم حقنة سعة 5 mL لدفع محلول رينجر بعناية عبر القطب الكهربائي الدقيق حتى تظهر كمية صغيرة من المحلول على الطرف. الآن، ضع القطب الكهربائي الدقيق الخاص بالتسجيل بعناية في الميكرو-مانيبولاتور (micro manipulator) وقم بتوصيل السلك بنظام التسجيل للتحقق من وجود ضوضاء في النظام. ضع القطب المرجعي وطرف القطب الكهربائي الدقيق الخاص بالتسجيل في طبق بتري بقطر 35 mm مملوء بمحلول رينجر.افحص مستويات الضوضاء الكهربائية في التجهيزات باستخدام راسم الإشارة (oscilloscope) أو ميزة مدمجة في جهاز ERG. يجب ألا تتجاوز مستويات الضوضاء موجب أو سالب 10 microvolts من الخط القاعدي. في هذا الإجراء، قص عدة مربعات من المناديل الورقية بمساحة سنتيمتر مربع واحد لكل منها، ثم خدر ثلاث إلى خمس يرقات في طبق بتري بقطر 35 millimeter عن طريق إضافة trica ليكون التركيز النهائي 0.02% والانتظار لمدة دقيقة إلى دقيقتين.بعد ذلك، انقل يرقة واحدة بعناية إلى مربع من الورق المناديل تحت مجهر تشريحي ستيريوسكوبي مع تقليل الإضاءة إلى أدنى حد. تحقق من وضع اليرقات واختر عينة يكون جانبها الظهري للأعلى مع عين مسدودة لجلسات التسجيل التي تستمر لأكثر من 30 دقيقة. حافظ على رطوبة اليرقة عن طريق طلاء الجسم بـ 3%methylcellulose باستخدام فرشاة شعر جمل رفيعة.بعد ذلك، انقل قطعة المناديل الورقية التي تحتوي على اليرقة إلى إسفنجة PVA المبللة. ثم، قم بتوجيه تدفق مستمر من الماء المشبع بـ 100% oxygen فوق اليرقات عن طريق تمرير الغاز عبر حجر توزيع الهواء (airstone) في دورق ذي ذراع جانبية يحتوي على ماء مقطر. قم بتوجيه الأكسجين المرطب من الذراع الجانبية للدورق بالقرب من رأس اليرقة باستخدام أنبوب تحت إضاءة خافتة.استخدم الميكرومناور والكاميرا لضبط موضع طرف القطب الكهربائي الدقيق في النقطة المتوسطة بين الطرفين الأنفي والذيل العين، ثم اضغط برفق على الحد الظهري للقرنية. اترك اليرقات تتكيف مع الظلام لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. بعد ذلك، سجل استجابات ومضات الاختبار للضوء المنبعث من مصدر ضوء LED أو محفز بصري.يوضح هذا الشكل تسجيلاً نموذجياً لتخطيط كهربائية الشبكية (ERG) في يرقة سمكة الزبرا في اليوم الخامس بعد الإخصاب (5 DPF). تعرضت الأسماك المتكيفة مع الظلام لضوء LED أبيض لمدة 20 ميلي ثانية بشدات تتراوح من 1 إلى 5,000 كانولا لكل متر مربع، مع بدء التحفيز الضوئي عند الثانية صفر. ومن الصعب تمييز موجة (a) ذات الجهد السالب، بينما تمثل موجة (b) ذات الجهد الموجب القمة المهيمنة في شكل الموجة.يوضح هذا المربع الداخلي متوسطات سعة استجابة الموجة B التي تمت ملاءمتها باستخدام معادلة Naka-Rushton. يظهر هذا الشكل تسجيلاً نموذجياً لتخطيط كهربائية الشبكية (ERG) في يرقة سمكة الزيبرا في اليوم الخامس بعد الإخصاب (5 DPF) والمتكيفة مع الظلام والمعالجة بـ PB. يتم تعريض الأسماك لضوء LED أبيض لمدة 20 ميلي ثانية بكثافات تتراوح من 1 إلى 5,000 candela per square meter، ويمثل جهد مستقبل كتلة المخاريط المنعزل العنصر المهيمن في شكل الموجة. يوضح هذا المربع الداخلي متوسطات سعات الاستجابة ليرقة سمكة الزيبرا المعالجة بـ PB والتي تمت ملاءمتها باستخدام معادلة Naka-Rushton.يوضح هذا الشكل تسجيلاً نموذجياً للتخطيط الكهربائي للشبكية (ERG) في يرقات سمكة الزبرا المعالجة بـ D-P-F-A-P-B لمدة خمسة أيام، وذلك باستخدام نموذج الومض المزدوج. حيث يتم تعريض الأسماك المتكيفة مع الظلام لومضات متتالية من الضوء الأبيض مدتها 20 millisecond.تومض صمامات LED بكثافة قدرها 1000 canula لكل متر مربع، ويبلغ الفاصل الزمني بين الومضات (ISI) ثانيتين. تم تحديد بداية كل محفز ضوئي هنا. يوضح هذا الشكل نسبة الاستجابة القصوى لجهد مستقبلات كتلة المخاريط المعزولة للمحفز الثاني إلى استجابة المحفز الأولي مع زيادة الفاصل الزمني بين الومضات (ISI)، مما يشير إلى التعافي التدريجي لحساسية المستقبلات الضوئية.أثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن جودة التسجيلات تعتمد على سلامة اتصال القطب الكهربائي بالقرنية وعلى صحة اليرقات. لقد أدى تطوير هذه التقنية إلى تعزيز قدرة الباحثين في علوم الرؤية بشكل كبير على استكشاف تكيف المخاريط وتعافيها في شبكية الفقاريات في الجسم الحي (in vivo).

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

طورنا الاستجابة الحسية الحركية لquantitate إخراج السيارات من الزرد اليرقات ردا على الزيادات الخفيفة والتناقصات. فحصنا أيضا المسوخ رؤية الزرد ، بما في ذلك أي optokinetic المسوخ (NRC) ردا على ذلك ، الذي كان يعتقد أن يكون أعمى تماما عند اختباره آخر مقايسة الرؤية ، والمنعكس optokinetic.

والفحص السلوكية لقياس الاستجابة للاسماك الزرد إلى التغيرات في شدة الضوء

وكان رد Optokinetic المستخدمة على نطاق واسع لتقييم الوظائف البصرية الزرد اليرقات. ومع ذلك ، فإن بروتوكول قياسي للأسماك اليرقات ليست سهلة التطبيق حتى الآن في...

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

وVisioTracker هو نظام آلي لتحليل كمي لأداء البصرية من الأسماك البالغة اليرقات الصغيرة ويعتمد على تسجيل حركات العين. ويتميز السيطرة الكاملة على خصائص التحفيز البصري والتحليل في الوقت الحقيقي، وتمكين عالية الإنتاجية البحوث في مجالات مثل تطوير النظام البصرية وظيفة، والصيدلة، والدراسات الدوائر العصبية الحسية والتكامل.

VisioTracker، نهجا مبتكرا لتحليل الآلي المحرك للعين

يصف هذا الفيديو مقايسة الاستجابة الحركية الضوئية لأسماك الزرد ويرقات البلم السمينة باستخدام برنامج تتبع آلي. يقيس البروتوكول الاستجابة السلوكية لأسماك اليرقات بعد تغيير مفاجئ في حالة الإضاءة.

فحص الاستجابة الحركية الضوئية: طريقة لقياس الاستجابة السلوكية ليرقات الزرد لتغيير مفاجئ في حالة الإضاءة

يصف هذا الفيديو مقايسة الاستجابة البصرية في الزرد. يقيس الفيديو حركات العين الانعكاسية بناء على التحفيز المتحرك البصري ويحدد حدة البصر في الزرد.

مقايسة الاستجابة البصرية: طريقة لقياس حدة البصر في أسماك الزرد

يوضح هذا الفيديو طريقة دراسة الكشف البصري عن الفرائس في يرقات الزرد المعدلة وراثيا باستخدام التصوير الفلوري القائم على مؤشر الكالسيوم مع الخلايا العصبية التي تعبر عن مجمعات مؤشر الكالسيوم الفلورية.

تحليل النشاط العصبي المستحث في الفريسة في يرقة الزرد المعدلة وراثيا

وقد الزرد أداة قيمة بالنسبة للعديد من المجالات البحثية. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة للحصول على رد البصرية وحساب البصر وظيفية في الزرد الكبار.

استجابة حركة العين باعتبارها قياس الكمي لحدة البصر في الزرد

نقدم طريقة فعالة لتسمية الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) في أسماك الزرد البالغة.

وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون

هنا، نقدم بروتوكولا لتطوير وتوصيف نموذج حمار وحشي من الصرع الناجم عن تثبيط عابر للجين DEPDC5.

التحليل السلوكي والفسيولوجي في نموذج حمار وحشي من الصرع

نقدم هنا، بروتوكول أن يبسط قياس الاستجابات اليكتروريتينوجرام مقولة الخفيفة من الزرد اليرقات. يمكن أن تساعد مسرى رواية على شكل مخروط الأسفنج-تلميح جعل دراسة التنمية البصرية في الزرد اليرقات باستخدام اليكتروريتينوجرام أرج أسهل تحقيقا مع نتائج موثوق بها، وانخفاض التكلفة.

تسجيل اليكتروريتينوجرام في "الزرد اليرقات" استخدام القطب نصيحة الأسفنج على شكل مخروط رواية A

يشرح المقال كيفية إزالة العينين جراحيا من يرقات الزرد الحية كخطوة أولى نحو التحقيق في كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو التكتوم البصري وتطوره. بالإضافة إلى ذلك ، توفر المقالة معلومات حول تخدير اليرقات وتثبيتها وتشريح الدماغ ، تليها الكيمياء النسيجية المناعية والتصوير البؤري.

إزالة العين في يرقات الزرد الحية لفحص النمو والتطور المعتمد على التعصيب للنظام البصري

تعلم تقنية تخطيط كهربية الشبكية في يرقات سمك الزرد لدراسة وظائف المخروطات البصرية في شبكية الفقاريات. هذه الطريقة تتيح للباحثين تقييم الوظيفة البصرية في النموذج الحي بكفاءة.

تحليل مخطط كهربية الشبكية من الاستجابة البصرية في الزرد اليرقات

استكشف المزيد من الفيديوهات