ل

الهدف العام من التجربة التالية هو تطبيق نموذج السكون في المختبر هذا لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية، ووضع فرضيات لاختبارها في نماذج حية أكثر تعقيداً من الناحية البيولوجية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق استنبات خلايا سرطان الثدي الإيجابية للإستروجين في أطباق استنبات أنسجة مشفرة بالفبرين بكثافة متجانسة، حيث تكون تفاعلاتها في المقام الأول مع الطبقة التحتية وليس مع بعضها البعض. وكخطوة ثانية، يتم تنشيط حالة السكون في بعض الخلايا الإيجابية للإستروجين بدعم وحفاظ من FGF two والفبرونكتين، وهو ما يمثل خلايا سرطان الثدي في نخاع العظم.

بعد ذلك، يتم تحفيز النظام عن طريق إضافة أجسام مضادة، أو مثبطات، أو ببتيدات، أو أحماض نووية من أجل تعطيل جوانب نمطية وجزيئية مختلفة من الخلايا الساكنة وتحديد دورها في الحفاظ على حالة السكون. وتظهر النتائج عدد ومظهر المستعمرات النامية والساكنة التي نتجت عن معالجة الخلايا المحضنة بـ FGF two على أطباق مغلفة بالـ fibronectin. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد مسارات الإشارة، أو جزيئات الالتصاق، أو الآليات الجزيئية المحددة الأخرى المسؤولة عن تطوير السكون والحفاظ عليه في خلايا سرطان الثدي المعتمدة على الإستروجين والموجودة في البيئة الدقيقة لنخاع العظم.

للبدء، قم بشفط وسط المزرعة من الأطباق التي بلغت نسبة تلاقي الخلايا فيها حوالي 50% من seven cell lines CF و RINs، ثم اشطفها بمحلول PBS الدافئ مسبقاً. بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول trypsin EDTA بتركيز 0.25 المذاب في وسط DMEM عالي الجلوكوز والخالي من مصل العجل الجنيني. قم بحضن الأطباق لمدة تتراوح من 1 إلى 4 دقائق عند 37 °C حتى تبدأ الخلايا في الانفصال.

بمجرد أن تنفصل الخلايا عن الطبق وتبدأ في تشكيل معلق من الخلايا المفردة، قم بتفكيك أي تجمعات خلوية متبقية عن طريق السحب والطرد باستخدام ماصة سعة 2 mL لعدة مرات. إذا ظلت التجمعات الخلوية موجودة بعد أربع دقائق من المعالجة بالتريبسين، تخلص من الخلايا وقم بتحضير مزارع خلوية جديدة، حيث إن بقاء الخلايا ملتصقة ببعضها البعض بعد أربع دقائق سيؤدي على الأرجح إلى حدوث خطأ عند عد أعداد المستعمرات. قم بترسيب الخلايا المعالجة بالتريبسين وأعد تعليقها بتركيز 1,500 خلية لكل 1 mL في وسط استنبات، واستخدم ماصة سعة 5 mL لخلط معلق الخلايا عن طريق السحب والطرد بلطف، ثم قم بعد الخلايا والتحقق من أن المعلق يتكون بشكل أساسي من خلايا مفردة باستخدام عداد خلايا آلي.

يمكن القيام بذلك أيضاً يدوياً باستخدام غرفة عد تحت مجهر تباين الأطوار. بعد ذلك، اسحب ثلاثة ملليلتر من معلق الخلايا ووزع ملليلتر واحد في كل مرة في اثنين من آبار لوحة ذات 24 بئراً مغطاة بالفبرونكتين. ولتحسين التوزيع المكاني للخلايا، تأكد من سحب المعلق بالماصة في منتصف البئر وعدم تعريض اللوحة لمزيد من الحركة قبل أن تستقر الخلايا وتلتصق.

أعد ما تبقى من معلق الخلايا إلى خليط الخلايا الرئيسي، ثم اخلط الخلايا مرة أخرى قبل سحب ثلاثة ملليلترات أخرى. سيقلل هذا الإجراء من تباين عدد الخلايا نظراً لترسب الخلايا المستمر في الأنبوب، كما أن العمل بالماصة يضمن توزيع أحجام الخلايا الكبيرة بسرعة؛ لأن ترك الخلايا في المعلق في درجة حرارة الغرفة وتركيز CO2 سيؤدي إلى تعديل إمكاناتها الجينية المتماثلة. قم بحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و5% CO2. ويُعتبر هذا اليوم هو اليوم ناقص واحد.

في الجدول الزمني للتجربة، وفي اليوم صفر من المقايسة، استبدل الوسط بـ 1 mL من وسط طازج، أو وسط طازج يحتوي على 10 ng/mL من fibroblast growth factor 2؛ حيث إن العدد القليل من الخلايا في البئر بعد ستة أيام لن يؤثر بشكل كبير على تركيبة العناصر الغذائية أو السيتوكينات ولا على pH الوسط الأصلي.

في اليوم الثالث، أضف 100 µL من محلول يحتوي على 10 أضعاف التركيز النهائي المستهدف من عامل مُحدث للاضطراب، مثل مثبط PI three kinase، LY 2 9 4 0 0 2 أو ضابط سلبي LY 3 0 3 5 1 1 أو ضابط الوسط الغذائي، إلى 1 mL من الوسط الموجود مسبقاً في الآبار، واترك المحاليل تمتزج عن طريق الانتشار. أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة ثلاثة أيام إضافية. وفي اليوم السادس، أذِب 0.1% من crystal violet في محلول مكون من 2% إيثانول و 10 mM من بورات الصوديوم.

عند pH تسعة، قم بشفط الوسط من الآبار وأضف 1 mL من محلول الكريستال البنفسجي إلى كل بئر لمدة 20 دقيقة. قم بإعداد محطة الغسيل بوضع دلو من الثلج في الحوض مع جعل المياه تتدفق باستمرار في الدلو، واغسل الأطباق بغمرها في الماء بحيث تكون فتحات الآبار متجهة للأسفل بزاوية حادة داخل الدلو. أمل الطبق إلى زاوية أفقية بمجرد غمره تحت الماء بحيث تكون فتحات الآبار متجهة للأسفل.

بعد ذلك، قم بإمالة الطبق مرة أخرى بزاوية حادة وارفع الطبق بحركة انسيابية لطيفة واحدة. كرر عملية الغمر مرتين أو ثلاث مرات حتى لا يظهر اللون الأزرق في الماء الموجود في قاع الآبار. ثم ضع الأطباق مقلوبة على مناشف فوق سطح المختبر لتجف طوال الليل.

بمجرد الجفاف، ضع الطبق تحت مجهر تباين طور مقلوب وقم بعدد المستعمرات النامية والخاملة في كل بئر. عند تكبير 40 x، تُعد المستعمرات التي تزيد عن 30 خلية على أنها نامية، والمستعمرات التي تتكون من 12 خلية أو أقل على أنها خاملة. موضح. يظهر هنا المظهر النموذجي للمستعمرة النامية والمستعمرة الخاملة.

تحتوي المستعمرات النامية على أكثر من 30 خلية، بينما تحتوي المستعمرات الخاملة على 12 خلية أو أقل، والتي تكون أكبر بكثير من الخلايا النامية مع وجود نسب سيتوبلازم إلى نواة كبيرة دون إضافة FGF two إلى المزرعة. وتتمثل المستعمرات بشكل أساسي في النسائل النامية. وبينما تكون الغالبية العظمى من النسائل خاملة في وجود FGF two، يمكن أيضاً تقييم تأثير عوامل إضافية باستخدام هذا النظام. هنا، تمت إضافة عاملين مسببين للاضطراب بتركيزات محددة مسبقاً إلى الآبار في اليوم الثالث من مقايسة Congenic.

يمثل الشكل تثبيطاً تفضيلياً للمستنسخات الكامنة بواسطة مثبط PI three kinase المسمى LY 2 9 4 0 2، بينما يظهر عدم وجود تأثير للمجموعة الضابطة السالبة LY 3 0 3 511. يمكن استخدام هذه التجارب للمساعدة في فهم العناصر التي تحكم حالة الكمون والمقاومة للعلاج. هنا، فقدت الخلايا الكامنة الناجية والمعالجة بمثبط PI i three kinase مظهرها المنتشر، وأصبحت شجيرية صغيرة وبدت مجهدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء هذا المقايسة المتجانسة لنمو الخلايا الساكنة، وكيفية تحفيز الخلايا عن طريق إضافة مثبطات محددة أو عوامل تحفيز بعد تحقيق حالة السكون، وكيفية قياس تأثير عوامل التحفيز هذه. يمكن استخدام هذه المقايسة لتقييم النتائج الكمية والنوعية على حد سواء، وذلك عن طريق عد المستعمرات الساكنة أو قياس أي عدد من الأحداث المناعية المظهرية أو الجزيئية أو البنيوية الفائقة في الخلايا الساكنة والمحفزة. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.