الكمي لحماية عائية عصبية بعد المتكرر نقص الأوكسجين شروط مسبقة وعابر الأوسط الشريان الدماغي انسداد في الفئران

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس مدى الحماية العصبية التي تلي التكييف المسبق بنقص الأكسجة المتكرر (RHP) من خلال قياس حجم الاحتشاء وسلامة الحاجز الدموي الدماغي في آن واحد. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض الفئران لتسع مرات من نقص الأكسجة العشوائي التي تختلف في مدتها وشدتها لتوفير حماية وعائية عصبية من السكتة الدماغية. بعد ذلك، يتم تحفيز السكتة الدماغية في الفأر يليه حقن صبغة إيفانز الزرقاء (Evan's blue).

يرتبط صبغ إيفانز الأزرق (Evan's blue) بشكل انتقائي بالألبومين، مما يسمح بقياس مدى تمزق الحاجز الدموي الدماغي بعد تضحية الحيوان عقب الحقن. يتم استئصال الدماغ وصبغه بـ TTC لقياس حجم المنطقة المصابة بالاحتشاء. وتظهر النتائج الفوائد الوقائية العصبية للتكيف المسبق مع نقص الأكسجين المتكرر لدى الفئران بعد السكتة الدماغية الإقفارية.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التكييف المسبق بنقص الأكسجة بتعرض واحد، في أن الـ RHP توفر حماية عصبية لمدة ثمانية أسابيع على الأقل في الفئران. ويمكن لهذه الطريقة الكمية المزدوجة الإجابة على أسئلة رئيسية في أبحاث السكتة الدماغية، مثل كيفية قياس أحجام الاحتشاء بالتزامن مع اختلال الحاجز الدموي الدماغي. ورغم إمكانية استخدام هذه الطريقة لتقديم رؤى حول السكتة الدماغية الإقفارية، إلا أنه يمكن تطبيق RHP أيضاً على حالات مرضية أخرى مرتبطة بالالتهابات الجهازية أو تلك التي تصيب الجهاز العصبي المركزي. للبدء، قم بتقسيم الفئران إلى مجموعتين.

تقوم مجموعة RHP، التي تتعرض لنسب أكسجين تبلغ 8% و11%، ومجموعة الضبط، التي تتعرض لنسبة أكسجين تبلغ 21% بالتزامن، بإزالة غطاء المرشح العلوي لكل قفص، ثم وضع القفص مع إبقاء زجاجات الطعام والماء في مكانها داخل الغرف المتصلة بخزانات الأكسجين الخاصة بكل منها. أغلق غطاء الغرفة وأحكم إغلاقه. افتح صمام الغاز الرئيسي للخزانات واضبط التدفق الأولي لكل غرفة تحريض على لترين في الدقيقة أو LPM.

بعد مرور خمس دقائق من التعرض، خفّض معدل التدفق إلى 1 LPM لما تبقى من فترة التعرض. وفي نهاية فترة التعرض، خفّض التدفق إلى 0 LPM وأغلق صمام الغاز. بالنسبة للخزانات.

افتح أغطية الغرف واستبدل الغطاء العلوي للمرشح في كل قفص. ضع الأقفاص في مسكن قياسي حتى التعرض التالي لنقص الأكسجة. قم برش كل غرفة تحريض بمطهر ومزيل للروائح بعد كل استخدام.

عرّض كل من الفئران في مجموعة RHP ومجموعة الضبط في نفس الوقت من اليوم على مدار أسبوعين من البروتوكول. ثم قم بإجراء انسداد مؤقت للشريان المخي الأوسط أو A-T-M-C-A-O كما هو موضح في النص. يجب إجراء حقن EB بعد 22 ساعة من إعادة التروية، ويجب أن يظل متداولاً في مجرى الدم لمدة ساعتين قبل التضحية وإجراء صبغ NTTC.

قم بتحضير كمية EB المطلوبة للحقن. ثم اسحب الكمية المحددة في درجة حرارة الغرفة إلى محقنة أنسولين سعة 0.3 cc. وباستخدام إبرة قياس 29، قم بتثبيت الفأر باستخدام مثبت ذو قاعدة مسطحة.

أمسك الذيل بحيث يكون الوريد الجانبي في الأعلى. تقع الأوردة الجانبية على كلا جانبي الخط المركزي للذيل. أمسك طرف الذيل لتثبيت الفأر أثناء الحقن.

أدخل الإبرة في الوريد لمسافة تتراوح بين ثلاثة إلى خمسة مليمترات تقريباً. مع الحرص على عدم ثقب الوريد، احقن كامل الصبغة على مدار دقيقة واحدة. إذا كان المحلول يتدفق إلى الوريد، فيجب أن تكون المقاومة في حدها الأدنى عند الضغط على المحقنة.

تأكد من نجاح الحقن الوريدي الجهازِي لـ EB من خلال التغير اللوني الفوري في أطراف الذيل وعيون الفأر. اسحب الإبرة من الذيل وطبق ضغطاً خفيفاً باستخدام شاش نظيف لوقف النزيف. ابدأ حساب الوقت.

عندما يتحول جلد الفأر إلى اللون الأزرق، اترك مادة EB تدوّر لمدة ساعتين لتخترق الحاجز الدموي الدماغي الضعيف. يجب أن يتم التروية وصبغ TTC بعد 24 ساعة من إعادة التروية، أي بعد 24 ساعة من T-M-C-A-O وساعتين من إعطاء EB، ثم يتم التضحية بالحيوان عن طريق جرعة زائدة من isof fluorine في غرفة تحريض صغيرة. يجب أن تبدأ التروية فور التضحية لتقليل التحلل الذاتي، الذي يبدأ في غياب الأكسجين بعد الوفاة.

قم بتثبيت الحيوان بسرعة على منصة من البوليسترين مع تثبيت الساعدين من خلال القوائم. قم بعمل شق جانبي عبر جدار البطن من الخط الناصف أسفل القفص الصدري مباشرةً. اقطع الحجاب الحاجز بعناية لكشف القلب.

ابدأ تشغيل مضخة التروية بمعدل تدفق قدره 5 ml/min باستخدام محقنة سعة 60 cc مملوءة بـ 0.01 molar phosphate buffered saline أو PBS بارد جداً، ومتصلة بإبرة حقن مجنحة قياس 27 gauge. ضع طرف الإبرة على عمق 0.5 cm تقريباً داخل البطين الأيسر للقلب وقم بقص الأذين الأيمن. يجب أن يتدفق الدم الوريدي المخفف تدريجياً من الأذين أثناء التروية حتى يظهر الدم الوريدي عديم اللون. قم بتروية القلب بـ 30 ml من 0.01 molar PBS عبر القلب.

بعد ذلك، أضف خمسة ملليلتر من محلول TTC في 20 زجاجة وميضية شفافة. فور الانتهاء من عملية التروية، قم بفصل رأس الحيوانات واستئصال الأدمغة باستخدام مقصات صغيرة وملعقة مسطحة إذا لزم الأمر. تحقق من أن نصف الكرة المخية المقابل للشريان المخي الأوسط المسدود يظهر باهتًا دون وجود تسرب ملحوظ لـ EB أو وذمة.

صب التالي محلول PBS في قالب أكريليك للدماغ مصمم لعمل مقاطع إكليلية بسمك 1.0 مليمتر من دماغ الفأر. ضع الدماغ في القالب بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى، ثم صب محلول PBS فوراً فوق الدماغ. حافظ على رطوبة الدماغ.

قم بإزالة البصيلات الشمية عن طريق إدخال شفرة من الفولاذ المقاوم للصدأ، بسمك 0.21 millimeter، في الفتحة الثانية من الجانب المنقاري للمصفوفة. ثم قم بإزالة المخيخ عن طريق إدخال شفرة في الفتحة الرابعة من الجانب الذيلي للمصفوفة. أدخل شفرة في الفتحة الوسطى من الفتحات المتبقية في المصفوفة.

بعد ذلك، أدخل الشفرات المتبقية بحيث تنصف الأنسجة المتبقية بالتساوي لضمان توزيع الأنسجة بشكل أكثر تجانساً أثناء عملية التقطيع. وبمجرد إدخال جميع الشفرات، أضف قطرة إلى قطرتين من PBS إلى الدماغ لترطيبه. تالياً، قم بإزالة الشفرات واحدة تلو الأخرى من القالب، بدءاً من المنطقة المنقارية.

احتفظ بالشرائح السبع الأولى لتحليل TTC. بعد عملية T-M-C-A-O، استخدم ملعقة صغيرة لنقل الشرائح بعناية من الشفرة إلى القارورة المملوءة بـ TTC. بعد وضع جميع المقاطع في القارورة، أغلقها بإحكام وضعها في حمام مائي دافئ حتى تتحول المقاطع إلى اللون الوردي.

أدرِ الزجاجة بلطف في الحمام إذا لزم الأمر لتجنب تداخل المقاطع، الأمر الذي قد يؤدي إلى صبغ غير متساوٍ. ثم تخلص من TTC واسكب محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4% في القارورة لتغطية مقاطع الدماغ. يؤدي ذلك إلى إيقاف التفاعل الكيميائي لـ TTC.

قم بترتيب المقاطع فوراً على شريحة زجاجية نظيفة بمقاس بوصة واحدة في ثلاث بوصات، ووجه المقاطع من الجهة المنقارية إلى الذيلية عند ترتيبها على الشريحة. قم بمسح الشريحة ضوئياً، وباستخدام ماسح ضوئي قياسي، اضبط الدقة على 600 DPI كحد أدنى لتحليل الصور.

تأكد من تضمين اسم الحيوان ومسطرة قياس مترية في الصورة الممسوحة ضوئياً. وأخيراً، اقلب الشريحة وامسح الجانب الخلفي لضمان جمع كافة البيانات. يقلل RHP من أحجام الاحتشاء بنسبة 46% مقارنة بفئران المجموعة الضابطة، ولكن ليس له أي تأثير على تورم نصف الكرة المخية المستمد من بيانات TTC في الحيوانات نفسها.

يقلل RHP من اختلال الحاجز الدموي الدماغي، كما هو محدد من خلال تسرب صبغة Evans Blue المقيس بالنسبة إلى نصف الكرة المخية المقابل؛ وتظهر هنا صبغات TTC ممثلة لكل من المجموعة المعالجة بـ RHP ومجموعة التحكم المعرضة لأكسجين بنسبة 21%. تظهر الفئران مع أحجام الاحتشاء المقابلة وتسرب صبغة Evans Blue المدرجة أسفل كل عينة هنا. يشير المصطلح "Ipsilateral" إلى نصف الكرة المخية المصاب بنقص التروية، بينما يشير "contralateral" إلى الجانب غير المتأثر من الدماغ.

عند تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر حقن صبغة إيفانز الزرقاء (Evan's blue) بعد 22 ساعة من الاندماج، وتركها تتدفق لمدة ساعتين قبل تضحية الحيوان بعد تطور الحالة. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية لاستكشاف آليات الحماية الداخلية من السكتة الدماغية في الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية قياس التأثير الواقي للأعصاب لـ RHP من خلال التحديد الكمي المزدوج لسلامة الحاجز الدموي الدماغي وأحجام الاحتشاء.