جل الآلي الحجم التحديد لتحسين نوعية المكتبات تسلسل الجيل المقبل من إعداد من عينات المياه البيئة

يوضح هذا الفيديو استخدام جهاز آلي لاختيار حجم الهلام لتحقيق قراءات محسنة في منصات تسلسل الجيل التالي. أولاً، يتم جمع عينات المياه البيئية وتمريرها عبر سلسلة من المرشحات لفصل الجسيمات ذات الأحجام الحقيقية والنوتية والفيروسية بشكل منهجي. ثم يتم تركيز البكتيريا المحتجزة بشكل أكبر عن طريق الطرد المركزي.

بعد ذلك، يتم استخلاص الحمض النووي البكتيري. ويُستخدم الحمض النووي المستخلص لإعداد مكتبات يتم فيها دمج المحولات والفهارس في قطع الحمض النووي المجزأة. ثم يتم تضخيم الحمض النووي بواسطة PCR، وتُحمل العينات في محطة عمل الرحلان الكهربائي.

يتم بعد ذلك اختيار قطع DNA ضمن نطاق محدد تلقائيًا. ويظهر تحليل الآثار الناتجة عن الفصل الكهربائي الشعيري القائم على الرقاقة والتحليلات المعلوماتية الحيوية الإضافية أن هذه الطريقة توفر كميات مناسبة من قطع DNA للتحليلات اللاحقة، مع الحد الأدنى من تجمّع القطع غير المرغوب فيها التي يقل طولها عن 200 base pairs. وتتمثل الميزة الرئيسية لمحطة الفصل الكهربائي المربعة المؤتمتة أو الخرزات البارامغناطيسية والأنظمة التجارية الأخرى في أنها تسمح بنطاق اختيار أكثر إحكامًا وضيقًا، حيث يمكن معالجة ما يصل إلى 96 عينة في تشغيلة واحدة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة حول المجتمعات الميكروبية في عينات المياه العذبة، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل مياه البحر، ومعالجة مياه الصرف الصحي، وعينات النباتات، وتربة الرواسب، أو الحصائر الميكروبية، وبشكل أساسي أي عينة DNA نرغب في إجراء اختيار دقيق لأحجام قطعها. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما لاحظنا وجود قطع قصيرة في تسلسلات منصة MySEQ. وقد جربنا عدة طرق لاختيار الحجم، بما في ذلك أنواع مختلفة من خرزات para ونسب متفاوتة، بالإضافة إلى طريقة اختيار الحجم اليدوية باستخدام الهلام (gel).

بعد ذلك، بدأنا التعاون مع شركة Coastal Genomics، وهي شركة خاصة مقرها كولومبيا البريطانية وتقدم تقنية Ranger لتوضيح هذا الإجراء. وسيكون معنا اليوم مايكل تشان، فني الأبحاث من مختبري، وميغيل يي، زميل ما بعد الدكتوراه من مختبري، وجاريد سلوان، المهندس من شركة Coastal Genomics. سنقوم في هذا الفيديو بوصف عملية تنقية وتحليل المواد المستخلصة من مرشحات 0.2 micron، وهي في الغالب بكتيريا حرة المعيشة، ولكن يجب الأخذ في الاعتبار إمكانية استخدام طرق مماثلة للجزيئات الأخرى المستخلصة من المرشحات.

ابدأ هذا الإجراء بجمع 40 لترًا من عينات المياه العذبة من عدة مواقع بيئية في قوارير (carboys) معقمة سعة 20 لترًا. قم بإجراء ترشيح أولي للعينات في الموقع باستخدام مرشح بولي بروبيلين شبكي (spectrum mesh) بقطر مسامي 105 ميكرومتر. يتم هنا جمع العينات من أحواض تصريف مياه متأثرة بالنشاط الحضري والزراعي.

بعد عملية الجمع، ضع العينات في مبردات وانقلها إلى المختبر. تُخزن العينات عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي.

قم بإعداد نظام ترشيح يتكون من قارورة تجميع العينات المتصلة عبر مضخة 연動ية بـكبسولة أخذ عينات "enviro check" بمسامية 1 ميكرون. وصّل كبسولة أخذ العينات بمرشح قرصي بمسامية 0.2 ميكرون، ثم وصّل الأخير بمرشح تدفق عرضي بسعة 30 كيلو دالتون عن طريق مضخة 연動ية ثانية. قم بتشغيل المضخات 연動ية لتمرير العينات عبر سلسلة من المرشحات، حيث سيتم عزل الخلايا حقيقية النواة أثناء مرورها عبر كبسولة أخذ العينات.

سيتم عزل الجزء البكتيري على قرص ترشيح غشائي، بينما يتم عزل الجزيئات الفيروسية على مرشح التدفق المماسي. قم بإزالة مرشح الغشاء بمقاس 0.2 micrometer أو المرشحات من نظام ترشيح المياه. بعد ذلك، اِطوِ المرشح إلى نصفين وضعه في أنبوب سعة 50 milliliter.

مع توجيه الفتحة إلى الأعلى، أضف 5 mL من محلول PBS مع tween إلى الأنبوب. إذا تم استخدام أكثر من مرشح واحد أثناء عملية الترشيح، فاستخدم أنبوباً مختلفاً لكل مرشح.

يمكن بعد ذلك تخزين المرشحات عند درجة حرارة 4 °C أو معالجتها فوراً على النحو التالي. بعد ذلك، وباستخدام ملقط معقم، أخرج مرشح الغشاء من أنبوب سعة 50 mL وضعه في طبق بتري باستخدام ملقط معقم ومقص معقم. قم بقص المرشح إلى قطع بحجم 1 cm × 1 cm بين العينات.

قم بتطهير الأدوات عن طريق نقعها في 70% isopropanol، ومسحها بمزيل تلوث الأسطح من DNA، ثم شطفها بماء فائق النقاء من النوع الأول. أعد قطع المرشح إلى نفس أنبوب الـ 50 milliliter. أضف 10 milliliters من PBS مع tween لرفع الحجم الإجمالي للمحلول المنظم إلى 15 milliliters باستخدام ملاقط معقمة.

أضف ست خرزات تنغستن نظيفة، بقطر 3 mm إلى كل أنبوب سعة 50 ml. غطِّ الأنبوب بورق البارافورم ثم قم برجّه باستخدام جهاز الـ vortex بقوة لمدة 20 دقيقة.

بعد الرج الدوامي، اجمع كافة المعلقات في أنبوب نظيف واحد سعة 50 milliliter لكل عينة. قم بطرد مركزي للأنابيب عند 3,300 GS لمدة 15 minutes عند درجة حرارة أربع degrees Celsius. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب.

في 5 mL من محلول PBS، وزع الخلايا البكتيرية في حصص بحجم 1 mL في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.7 mL، ثم قم بتدويرها في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 10,000 ×g لمدة 10 دقائق. بعد عملية التدوير، استخدم ماصة لإزالة كل السائل الطافي باستثناء 200 µL. تُحفظ العينات عند درجة حرارة -80 °C أو يتم البدء في استخلاص DNA البكتيري باستخدام طقم عزل DNA متاح تجارياً.

أثناء عملية استخلاص الحمض النووي البكتيري، استخدم إما PBS أو الماء كضابط استخلاص سلبي، وبكتيريا e coli كضابط استخلاص إيجابي. بعد إجراء عملية استخلاص الحمض النووي، قم بتجميع الأجزاء الموزعة من نفس العينة في أنبوب واحد سعة 2 mL يحتوي على 10 mM tris buffer. ثم قم بإجراء عملية ترييب طوال الليل عن طريق إضافة محلول يتكون من 10% 3 M sodium acetate، وحجمين من 100% ethanol، و 5 µL من linear acrylamide. تُحفظ العينات عند درجة حرارة -80 °C.

في اليوم التالي، قم بإجراء عملية طرد مركزي للعينات عند 17,000 GS لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد عملية الطرد، اغسل الراسب باستخدام واحد ملليلتر من الإيثانول 70% المبرد بالثلج، ثم اترك الراسب ليجف في الهواء داخل كابينة السلامة البيولوجية لمدة لا تزيد عن خمس دقائق.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق ركاز الـ DNA في 10 millimolar tris-CL. وفي النهاية، حدد كمية الـ DNA وجودته عن طريق إجراء مقايسة كمية للأحماض النووية باستخدام الفلورسنت عالية الحساسية، تليها قياسات الطيف المجهرية. بعد تحديد كمية الـ DNA في كل عينة، أضف الكمية المناسبة من الماء إلى كل أنبوب لضبط التركيز عند حوالي 0.2 nanograms per microliter.

باستخدام طقم تجاري متاح، قم بإعداد مكتبة DNA من شظايا مفهرسة من نانوجرام واحد من DNA البكتيري. هنا، يتم تطبيق طريقة تعتمد على إنزيم transpose تُعرف باسم mentation لتجزئة DNA ودمج تسلسلات الموائمات (adapter sequences) في آن واحد. بعد ذلك، يتم إجراء PCR لتضخيم وفهرسة عينات ED في وقت واحد، مما يوفر رموزاً شريطية (barcodes) محددة على كل شظية والتسلسلات المطلوبة لتكوين العناقيد (cluster formation) التي يمكن قراءتها بواسطة منصة التسلسل.

بعد الانتهاء من تفاعل PCR، تخطَّ خطوة التنقية القياسية التي تلي التفاعل، وأضف 3.5 µL من محلول التحميل (loading buffer) إلى كل عينة ليصل الحجم الإجمالي إلى 28.5 µL. بعد ذلك، انقل العينات إلى لوحة ذات 96 بئراً. ضع اللوحة ذات الـ 96 بئراً في محطة عمل الرحلان الكهربائي المزودة بكاسيت أغاروز مسبق الصب بتركيز 1.5% عبر واجهة مستخدم برنامج Ranger.

حدد هدف اختيار الحجم من 500 إلى 800 زوج قاعدي. اضبط حجم الاستخلاص على 300 µL. ابدأ عملية التشغيل.

ستقوم محطة عمل الرحلان الكهربائي بتحميل العينات تلقائياً في كاسيتات aros. بعد ذلك، يتم تطبيق جهد كهربائي على الكاسيتات، ويُستخدم نظام تصوير مثبت على هيكل جسري لتحديد موقع DNA العينة في aros. طوال فترة التشغيل.

يقوم برنامج Ranger بالتقاط الصور وتقدير موضع الهدف المختار حسب الحجم في كل عينة باستخدام معايير داخلية. وبعد تحديد الأهداف، يقوم برنامج ranger بتغيير الجهد الكهربائي المطبق على كل عينة لمزامنة وصول الأهداف إلى آبار الاستخلاص في الكاسيت.

أخيرًا، تقوم محطة عمل الرحلان الكهربائي بشفط الأهداف الموجودة في TBE من آبار الاستخلاص وتوزيعها في صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرًا لتركيز مادة المخرجات الخام، ومن ثم ترسيب حجم الاستخلاص الخام باستخدام خلات الصوديوم والإيثانول مع الأكريلاميد الخطي طوال الليل عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. يتم إجراء طرد مركزي للعينات مرة أخرى عند 17,000 GS لمدة 30 دقيقة. وبعد عملية الدوران، يتم التخلص من السوائل الطافية والمباشرة بغسل صفيحة الـ DNA باستخدام 1 مل من الإيثانول بتركيز 70% المبرد بالثلج عبر جهاز الطرد المركزي.

تُطرد العينات بسرعة 17,000 GS لمدة 30 دقيقة، ثم يتم التخلص من السائل الطافي، وتجفيف العينات، وأخيرًا إعادة تعليق كتلة الـ DNA في محلول tris CL بتركيز 10 millimolar. بعد ذلك، يتم توحيد العينات باستخدام حبيبات توحيد المكتبة (library normalization beads)، المرفقة في طقم تحضير المكتبة transpose on base. وأخيرًا، يتم إجراء تسلسل الـ DNA باستخدام منصة تسلسل من الجيل التالي (next generation sequencing platform) للحصول على قراءات أكثر دقة في منصات التسلسل من الجيل التالي، وذلك من خلال تحسين جودة مكتبات التسلسل.

تم أخذ عينات مياه من ثمانية مواقع مختلفة في مستجمع المياه، وأُعدت مكتبات DNA المرجعية من الجزء البكتيري المعزول كما هو موضح في مخطط الفصل الكهربائي هذا. تكونت مكتبات DNA الناتجة عن عينات المياه العذبة بعد تفاعل PCR، ولكن قبل عملية اختيار الحجم الآلية، من شظايا يتراوح حجمها من 50 base pairs وصولاً إلى 3000 base pairs. وبعد إجراء اختيار الحجم باستخدام المنصة الآلية عالية الإنتاجية، احتوت العينات على نطاق ضيق من شظايا DNA يتراوح بين 500 و 800 base pairs. وبذلك، أدى استخدام منصة اختيار حجم الهلام الآلية هذه إلى الحصول على إنتاجية مناسبة وتقليل تكتل الشظايا غير المرغوب فيها التي يقل حجمها عن 200 base pairs.

أدى تسلسل DNA لهذه المكتبة باستخدام جهاز MiSeq إلى توليد كثافة عناقيد بلغت 1198 K لكل مليمتر مربع. وكانت نسبة العناقيد التي اجتازت المرشحات 84.2% مع إنتاجية تقديرية بلغت 9.2 gigabytes. علاوة على ذلك، بلغت كمية القراءات التي سجلت درجة جودة أكبر من أو تساوي 30 نحو 7.4 gigabytes، أي بنسبة 82.8%.

وهذا يعني أن ما يقرب من 83% من القواعد التي تم تسلسلها باستخدام هذا البروتوكول المعدل والمطبق على عينات المياه البيئية كانت دقة تحديد القواعد فيها 99.9% على الأقل. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد بيانات أكثر إثراءً من مكتبات التسلسل. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الجزء الميكروبي الذي تستهدفه، واختيار طريقة تحضير المكتبة، وطول القطعة المستهدفة، ومنصات التسلسل.