ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير اختبار صفيحة دقيقة ثلاثية الأبعاد في المختبر لغزو الخلايا السرطانية. يتم تحقيق ذلك عن طريق توليد المنشطات الورمية ذات الحجم المتكرر أولا في تعليق في قاع دائري مرفق منخفض للغاية 96 ، لوحات جيدة في وقت واحد الستيرويد في كل بئر. الخطوة الثانية هي إزالة أجزاء من الوسط وإضافة غشاء القاعدي مثل المصفوفة أو BMM مباشرة إلى كل بئر لتوفير مصفوفة شبه صلبة تغزو فيها الخلايا السرطانية من جسم الستيرويد.

بعد ذلك ، يتم مراقبة غزو الستيرويد الورمي على فترات على مدى 72 إلى 96 ساعة يتم خلالها إجراء الحصول على الصورة إما تلقائيا على مقياس الخلوي أو يدويا على المجهر. الخطوة الأخيرة هي تحليل غزو الخلايا السرطانية إما من خلال مقياس خلوي آلي أو برنامج تصوير. في النهاية ، يتم استخدام اختبار غزو الستيرويد للورم ثلاثي الأبعاد لنمذجة غزو السرطان في المختبر بتنسيق أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية وقابلية لاستهداف دراسات التحقق من الصحة وفحص المخدرات.

نعتقد أن هذه التقنية مكملة لمقايسات تكاثر الخلايا ثنائية الأبعاد البسيطة المستخدمة عادة للتحقق من صحة الهدف وفحص الأدوية في أبحاث السرطان لأنها تمكننا أيضا من التحقيق في الغزو ، وهو جانب رئيسي من تطور السرطان بتنسيق ثلاثي الأبعاد ذي صلة من الناحية الفسيولوجية. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قمت بتحسين الورم ثلاثي الأبعاد ، النمو على صفيحة دقيقة. اعتقدت أنه سيكون من الجيد استخدام نفس الإعداد وإلقاء نظرة أيضا على الغزو ، وكانت النتيجة سهلة فقط لإزالة جزء من الوسط من كل بئر واستبداله بمصفوفة الغشاء القاعدي على حد سواء.

العرض البصري لهذه الطريقة ضروري كما الحفاظ على المنشطات في موقف مركزي من كل بئر بعد تقليد BMM يمكن أن يكون صعبا في البداية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تحليل الصورة دون المستوى الأمثل بسبب وجود المنشطات في مستويات بؤرية مختلفة. مع الخبرة.

نادرا ما يحدث هذا ، ولكن إذا لزم الأمر ، يمكن تسهيل العملية عن طريق الطرد المركزي اللطيف للوحة. لبدء كل BMM على ICE بين عشية وضحاها ، احتفظ بمجموعة من أطراف المرشح المعقمة للماصات P 10 E 200 و P 1000 والأنابيب المعقمة هي 20 درجة مئوية تحت الصفر. ضع أيضا الملحق المنخفض للغاية 96 لوحة البئر التي تحتوي على المنشطات التي يبلغ عمرها أربعة أيام على الجليد.

باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة 100 ميكرولتر برفق لكل بئر من وسط النمو من ألواح العصفور. بالنسبة لهذه الخطوة ، قم بزاوية الطرف باتجاه الجدار الداخلي لقاع U. حسنا ، تجنب ملامسة قاع البئر وموقع الشقوة.

من أجل تقليل اضطراب المنشطات باستخدام نصائح مثلجة باردة ، قم بنقل BMM إلى أنابيب مثلجة. للغزو الناجم عن السيتوكين أو لدراسات تقييم الأدوية ، أضف الكواشف إلى BMM باستخدام أطراف مثلجة. على سبيل المثال ، استخدم عامل نمو البشرة أو EGF لتحفيز غزو خلايا السرطان الحرشفية Cal S وخلايا السرطان الحرشفية.

ثم قم بتوزيع 100 ميكرولتر من BMM برفق في ubo. حسنا ، صوب الطرف نحو الجدار الداخلي للبئر. هذه الخطوة هي الأكثر أهمية.

أما بالنسبة لتحليل الصور البصرية, يجب أن تبقى المنشطات في مركز, حسنا. كرر هذه الخطوة لجميع الآبار المطلوبة ، مما يسمح بخمسة إلى ستة تكرارات لكل شرط. إذا لزم الأمر ، قم بالتغيير إلى طرف مبرد حديثا باستخدام إبرة معقمة.

قم بإزالة الفقاعات إن وجدت. استخدام المجهر للتحقق بصريا من الستيرويد في وضع مركزي إذا لم تكن الطرد المركزي اللوحة عند 300 مرات G لمدة ثلاث دقائق من أربع درجات مئوية. وهذا سوف يضمن أن المنشطات تقع مركزيا في كل بئر.

بعد ذلك ، انقل اللوحة إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية واترك BMM بالتصلب بعد ساعة واحدة. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر برفق لكل بئر من النمو الكامل. دراسات الغزو الناجم عن السيتوكين أو السيتوكين أو دراسات تقييم المخدرات.

قم بتضمين السيتوكينات أو المثبطات في الوسيط للحصول على الصور الآلي. مسح اللوحات على مقياس الخلايا على فترات. بدءا من الوقت صفر ، حدد تطبيق التقاء.

ثم تحقق من أن الستيرويد في التركيز. إذا لزم الأمر، اضبط التركيز يدويا وقم بإصلاح إزاحة التركيز البؤري. ضمن إعدادات أخذ العينات.

يقوم المحدد بفحص مجال رؤية مركزي واحد. بعد إضافة BMM ، يجب أن تظل ستيرويدات الورم في وضع مركزي. وبالتالي ليست هناك حاجة لمسح البئر بالكامل في البرنامج.

حدد الآبار المراد مسحها ضوئيا عن طريق تمييزها على خريطة اللوحة. ثم انقر فوق بدء المسح. لتحليل الصور الآلي، حدد تطبيق التقاء.

في علامة تبويب التحليل ، اضبط إعدادات التطبيق لإنتاج تجزئة دقيقة حول الستيرويد ، بما في ذلك عمليات الخلية والبوديا الغازية الممتدة إلى BMM. اضبط الإعدادات لكل خط خلية ورمية أو في نقاط زمنية مختلفة. تحقق من أن إعدادات التحليل مناسبة للمنشطات الأخرى في اللوحة بالنقر على عدد قليل من الآبار المختلفة.

إذا كان التجزئة لا يحدد بدقة الستيرويد, ضبط إعدادات التطبيق أكثر. انقر فوق بدء التحليل في علامة تبويب النتائج. تحقق من آبار متعددة للتحقق من جودة التحليل قبل تصدير بيانات مستوى البئر إلى برنامج جداول البيانات.

كرر التحليل لجميع النقاط الزمنية ، ثم احسب متوسط النسبة المئوية للالتقاء الآبار المكررة بالإضافة إلى الغزو مقابل الوقت في مخطط شريطي. باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية المفضلة للحصول على الصور يدويا ، استخدم مجهرا مقلوبا مزودا بهدف 10 x لتسجيل صورة لكل ستيرويد ورم على فترات. البدء من T يساوي صفرا بعد T يساوي ما بين 72 و 96 ساعة.

اعتمادا على سرعة غزو بطانة الخلية المعنية ، استخدم هدف الفوركس عندما تكون المنطقة التي تم غزوها كبيرة جدا بحيث لا يمكن التقاطها بالكامل داخل مجال الرؤية 10 ×. احفظ كل صورة فردية تم الحصول عليها لتحليل الصور يدويا. افتح صور الرسم البياني للمسرح في تحليل التصوير.

البرنامج المفضل للمعايرة هو صور الرسم البياني للمرحلة التي يتم أخذها. باستخدام كل من أهداف 10 x و four x. أدخل القياسات الرسومية والوحدات والأهداف المستخدمة وقم بإجراء المعايرة.

هذه الخطوة مطلوبة مرة واحدة فقط لتحليل الصور اللاحق. ما عليك سوى إعادة تحميل إعدادات المعايرة المطلوبة. بعد ذلك ، افتح صور فحص الغزو وحدد إعدادات المعايرة اعتمادا على هدف المجهر المستخدم للحصول على الصور.

قياس المنطقة التي تغطيها المنشطات في البرنامج المستخدم هنا. انتقل إلى قياس وحدد حجم العد. اختر أثناء التحميل ثم قم بتحميل الإعدادات وحدد إعدادات الفحص المحددة مسبقا.

ثم اختر العد. ثم ينبغي أن تكون مجزأة الستيرويد بدقة. قياسات التصدير هي معلمات مختلفة لجدول بيانات وتسجل معلومات الصورة ذات الصلة في جدول البيانات.

أخيرا, رسم متوسط مساحة تكرار المنشطات أو الغزو مقابل الوقت باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرمجيات الإحصائية. يظهر هنا كمثال على غزو الخلايا السرطانية الذي لوحظ في خط خلايا الورم الأرومي الدبقي U 87 MG ، والذي يمكن استخدامه لتجسيد غزو ورم الدماغ. بمجرد دمجها في خلايا BMM المنتشرة بنمط غزو انفجار نجمي نموذجي ، تتم متابعة العملية على مدى 72 ساعة.

تحليل تلقائي بالكامل للصور. ينتج عن استخدام مقياس الخلوي للصورة تجزئة حول نتوءات الخلية ويتيح القياس الكمي الدقيق لغزو الخلايا السرطانية. لاحظ أنه بالنسبة لخط الخلية هذا, يتم استبعاد الجسم الستيرويد من قياس المنطقة التي تم غزوها.

يتم إجراء تحليل الصور الآلي بالكامل بسهولة ويوفر القياس الكمي لغزو الخلايا السرطانية بمرور الوقت. يتم عرض نمط مختلف من غزو الخلايا من خلال الحرشفية البشرية والرأس والرقبة متساوية. خطوط الخلايا السرطانية Cal S حساسة لها ، و CAL R مقاوم لمثبطات التيروزين كيناز EG FFR.

في غياب EGF ، لم يتم غزو أي من خطي الخلية في BMM في وجود نتوءات تشبه الإصبع EGF ، مقذوفة من الجسم الرئيسي للمنشطات Cal ars. في حين أن خلايا Cal s كانت أقل توغلا بعد 72 ساعة ، تم الحصول على الصور في هذه الحالة بسرعة باستخدام مقياس خلوي للصور ولتجسيد طريقة بديلة ، تم تحديد درجة الغزو يدويا باستخدام برنامج تحليل الصور المستقل أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كل خط خلية يحتاج إلى تحسين قدرته على تكوين المنشطات ، كثافة بذر الخلية وتكوين المصفوفة وإعدادات الصورة والتحليل باتباع هذا الإجراء. نفس الطريقة التي يمكن تكييفها أيضا لتقييم غزو الأنسجة ثلاثية الأبعاد باستخدام ، على سبيل المثال ، الأورام في الزراعة المشتركة مع أجسام الأجنة لتشبه نسيجا معقدا أو عضويات أخرى مثل الخلايا النجمية للورم الدبقي أو مزارع القبو لسرطانات الجهاز الهضمي ، أو الكبد لسرطان الخلايا الكبدية ورم خبيث سرطان القولون.