Name: ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: تعلم تقييم غزو الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد باستخدام مصفوفة شبيهة بالغشاء القاعدي. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة سلوك الأورام في بيئة فيزيولوجية واقعية وتسريع اختبار الأدوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذا العمل من قبل المركز الوطني لاستبدال وتنقيحها والحد منها في الأبحاث (رقم G1000121 رقم المعرف 94513) و Oracle Cancer Trust. يتم دعم SE من قبل معهد أبحاث السرطان وأبحاث السرطان في المملكة المتحدة (رقم المنحة C309 / A8274). نحن نقر بتمويل NHS لمركز البحوث الطبية الحيوية التابع للمعاهد الوطنية لحقوق الإنسان.

1. توليد بتكاثر الأجسام الشبه الكروية ورم الحجم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 5 مل ل25 سم 2 أو 8-10 مل ل75 سم 2 قارورة)، إضافة انزيم تفارق الخلية (1 مل ​​25 سم 2 أو 2 مل 75 سم 2 قارورة)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق انفصال الخلايا تحت المجهر وتحييد انزيم تفارق الخلية مع كامل متوسطة النمو (5 مل ل25 سم 2 أو 8 مل ل75 سم 2 قارورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق خلية الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف، والاستفادة من الأنبوب وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من متوسط ​​النمو باستخدام ماصة P1000. وهذا ينبغي أن تسفر عن تعليق خلية واحدة دون كتل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتمييع تعليق خلية للحصول على 0،5-2 × 10 4 خلية / مل (تحتاج كثافة الخلية المثلى ليتم تحديدها لكل خط الخلية في سrder للحصول الكروية الورم من 300-500 ميكرون قطرها 4 أيام بعد خلية البذر 12،13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى خزان معقم و، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، الاستغناء عن 200 ميكرولتر / جيد في المرفق منخفضة للغاية (ULA) 96-جيدا لوحات أسفل الجولة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحات لحاضنة (37 ° C، 5٪ CO 2، 95٪ الرطوبة). بعد أربعة أيام، تأكيد بصريا تشكيل كروي الورم والمضي قدما في غزو مقايسة 3D. </li></ol> 2. 3D ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد BMM على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على مجموعة من النصائح مرشح العقيمة لP10، P200 والماصات P1000 وأنابيب معقمة (1.5 مل حجم أو أكبر اعتمادا على الحجم الكلي مطلوب) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ULA لوحات 96-جيدا تحتوي الكروية القديمة 4 أيام على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية، وإزالة بلطف 100 ميكرولتر / جيد للنمو المتوسطة من لوحات كروي. لهذه الخطوة زاوية النصائح نحو طجدار nside من الآبار U-القاع، وتجنب الاتصال مع الجزء السفلي من البئر وموقع الكروية. تقليل اضطراب الكروية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام النصائح المثلج، ونقل BMM لأنابيب الجليد الباردة. للغزو التي يسببها خلوى أو دراسات تقييم المخدرات، إضافة الكواشف (في 2X تركيز النهائي) إلى BMM باستخدام نصائح الجليد الباردة. على سبيل المثال، استخدم عامل نمو البشرة (EGF) لتحفيز غزو CAL S وCAL R الخلايا الحرشفية سرطان. مزيج جيد من قبل يحوم بلطف، وتجنب تشكيل فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء بلطف 100 ميكرولتر من BMM في البئر U-القاع، وتهدف غيض نحو الجدار داخل البئر. هذه الخطوة هي الأكثر أهمية كما، على تحليل الصور الأمثل، يجب أن تظل الكروية في وسط البئر 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.6 لجميع الآبار المطلوبة، مما يسمح 5-6 مكررات / حالة. إذا لزم الأمر، تغيير إلى طرف الطازجة المبردة. ملاحظة: عندما أكثر خبرة، dispenحد ذاته BMM باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة معقمة، إزالة الفقاعات، إذا كان موجودا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، والتحقق بصريا أن الكروية هي في موقع مركزي. إن لم يكن، أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. وسوف يضمن هذا الكروية تقع مركزيا في كل بئر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوحة لحاضنة عند 37 درجة مئوية، والسماح للBMM لترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق 1 ساعة، وذلك باستخدام ماصة الأقنية، إضافة بلطف 100 ميكرولتر / بئر الكامل متوسطة النمو. للغزو أو تقييم المخدرات الدراسات التي يسببها خلوى، وتشمل السيتوكينات أو مثبطات على المدى المتوسط ​​(1X التركيز النهائي). بدلا من ذلك، إذا لم يتم إضافة الكواشف إلى BMM في الخطوة 2.5، وإضافتها إلى وسيلة في هذه المرحلة (3X التركيز النهائي المطلوب). </li></ol> 3. الآلي الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات المسح على الكريات (للمواصفات انظر الجدول من المعدات والمواد) على فترات ستاrting من وقت صفر (T0 = يوم للمقايسة غزو إعداد، مباشرة بعد خطوة 2.10 تصل إلى 72 ساعة أو 96 ساعة للأبطأ غزو خطوط الخلايا السرطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التطبيق &quot;التقاء&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن كروي هو في التركيز، وإذا لزم الأمر، وضبط يدويا وإصلاح &quot;التركيز المقاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت &quot;ضبط أخذ العينات&quot;، حدد لمسح حقل مركزي واحد من عرض (فوف). بعد BMM بالإضافة إلى ذلك، يجب أن ظلت الكروية الورم في موقع مركزي، وبالتالي ليست هناك حاجة لفحص البئر كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرنامج، وتحديد الآبار التي يتم مسحها ضوئيا من خلال تسليط الضوء على الخريطة لوحة. انقر على &#39;بدء المسح الضوئي. ملاحظة: يتم حفظ المسح الضوئي تلقائيا، ويمكن إعادة النظر فيها في وقت لاحق خارج الخط. </li></ol> 4. الآلي تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التطبيق &#39;ملتقى&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في علامة التبويب &quot;تحليل&quot;، وضبط تطبيق صحيفةضبط أوجه (على سبيل المثال، &quot;الدقة&quot;: منخفضة، عادية، عالية؛ &quot;عتبة كثافة&quot;: 1-15) لإنتاج تجزئة دقيقة حول كروي، بما في ذلك عمليات الخلية وinvadopodia تمتد إلى BMM (انظر الشكل 1). ضبط الإعدادات لكل خط الخلية السرطانية و / أو عند نقاط زمنية مختلفة. تدابير تطبيق &quot;التقاء&quot; ل٪ من المساحة بشكل جيد من قبل الخلايا الغازية المشمولة في مجال الرؤية المحددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن إعدادات تحليل مناسبة (أي تجزئة دقيقة) لالكروية الأخرى في لوحة من خلال النقر على عدد قليل من الآبار المختلفة. إذا لم تجزئة الخطوط العريضة بدقة كروي، وضبط إعدادات التطبيق أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;ابدأ التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على علامة التبويب &quot;نتائج&quot;، والتحقق من الآبار متعددة للتحقق من نوعية التحليل. &quot;البيانات على مستوى حسنا&quot; التصدير إلى برنامج جدول بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repeaتحليل ر لجميع نقاط الوقت. حساب متوسط٪ التقاء للآبار تكرار والغزو مؤامرة (٪ التقاء) مع الزمن في الرسم البياني شريط، وذلك باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية في الاختيار. </li></ol> 5. دليل الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل صورة لكل كروي الورم على فترات بدءا من ر = 0 ما يصل الى 72-96 ساعة، وهذا يتوقف على سرعة اجتياح خط الخلية في السؤال، وذلك باستخدام مجهر مقلوب (لوحة 96-جيدا هذا يستغرق حوالي 20 - 30 دقيقة). استخدام هدفا 10X. استخدام الهدف 4X عندما غزت منطقة كبيرة جدا ليتم القبض تماما في مجال 10X نظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ كل صورة الفردية المكتسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمعايرة، التقاط صور من مرحلة graticule (1 مم) باستخدام كل أهداف 10X و4X (وحفظ الصور). </li></ol> 6. كتيب تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور المرحلة graticule في برنامج تحليل الصور في الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل غراتقياسات icule، الوحدات (ميكرون)، والأهداف المستخدمة (10X أو 4X) وأداء المعايرة. مطلوب هذه الخطوة مرة واحدة فقط. لتحليل الصور لاحقا، وذلك ببساطة إعادة ضبط المعايرة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور مقايسة الغزو واختر إعدادات المعايرة اعتمادا على الهدف المجهر (10X أو 4X) المستخدمة للحصول على الصور. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، الصور التي تم الحصول عليها استيراد على التصوير الكريات (الخطوة 3) وتحليل يدويا، كما هو موضح في الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر مقلوب (انظر النتائج هو موضح في الشكل 3 والشكل 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس المنطقة التي تغطيها الكروية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرمجيات المستخدمة هنا لممثل النتائج (للمواصفات انظر الجدول من المعدات والمواد)، انتقل إلى &quot;قياس&quot; وحدد &quot;عدد / حجم. اختار &#39;ملف&#39; ثم &#39;تحميل الإعدادات&#39; وحدد قبل تحديد أساضبط ص. ثم اختر &#39;عدد&#39;. ثم ينبغي أن تكون مجزأة بدقة كروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذهب بدلا من ذلك إلى &#39;تعديل&#39; ثم &#39;رسم / كائنات دمج &quot;لفتح نافذة&quot; العصا السحرية / تتبع. استخدام المؤشر عصا لانقر على الصورة كروي والحصول على تجزئة. اختر &#39;تتبع&#39; (في نافذة &quot;العصا السحرية&quot;) لتوضيح كروي يدويا باستخدام الماوس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياسات تصدير معلمات مختلفة (منطقة، قطر، محيط الخ) إلى جدول بيانات. سجل في جدول البيانات والمعلومات ذات الصلة الصورة (على سبيل المثال، وأيضا العدد، نقطة زمنية نسبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المنطقة متوسط ​​الكروية تكرار (الغزو) مقابل الوقت باستخدام الرسوم البيانية العلمية والبرامج الإحصائية. بدلا من ذلك، حساب التغير في منطقة كروي في كل نقطة زمنية، نسبة إلى المنطقة في ر = 0. ثم غزو مؤامرة (٪ T0) مقابل الوقت باعتباره جرا الخطيةالرقم الهيدروجيني. </li></ol>

<ol><li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li>
<li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li>
<li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma%3A+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448(2013).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415(2009).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems%3A+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431(2010).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li>
<li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li>
<li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847(2012).</li>
<li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+tissue+research%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li>
</ol>

كل الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح المتنافسة.

نماذج ورم المذكورين هنا (ورم أرومي وSCCHN) وقد تم اختيار خصيصا لتجسد لنا مقايسة 3D كما هي سريريا السرطانات الغازية محليا ذات الصلة مع الحاجة غير الملباة لعلاجات فعالة 12. بعد العلاج من تعاطي المخدرات، وتقييم التغييرات في المختبر الدوائية (PD) العلامات البيولوجية لا يمكن أن يؤديها بسهولة عن طريق طخة غربية أو المناعية لللست] بعد استخدام الكواشف محددة متاحة تجاريا للسماح الانتعاش خلية من BMM و / أو تحليل مناعي غزو الأجسام الشبه الكروية الورم عن طريق كله جبل تلطيخ. هذا الاختبار الغزو هو تقنية مفيدة للتقييم السريع واستنساخه من غزو الخلايا السرطانية في المتوسط ​​نصف صلب وبالتالي مناسبة خاصة بالنسبة للمستقبل في المختبر فحص المخدرات. الخلايا السرطانية تغزو المصفوفة بطريقة 3D لأنها انتشرت من &quot;الورم الصغير&quot;، ممثلة كروي الورم، وتمتد إلى extracellulAR-مثل مصفوفة البيئة. الحقيقي ثلاثة أبعاد للفحص هو واضح في شكل الخلية، والذي يختلف من شقة، مورفولوجيا الخلايا الملتصقة تفترض عندما تتحرك على ركيزة صلبة. يمكن تقدير درجة الغزو بسهولة باستخدام إما التصوير الكريات، مما يسمح للالآلي للقراءة بها، أو عن طريق استخدام المجهر القياسي في تركيبة مع برامج التصوير. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة مناسبة للتصوير الفلورسنت 13 (على سبيل المثال مع خطوط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية أو المسمى مسبقا مع الأصباغ الفلورية). طريقة بسيطة لأداء بالخطوة الحاسمة الوحيدة التي يمثلها إضافة BMM، عندما يكون هناك خطر إزعاج المركز الأساسي للكروي في شكل U جيدا. هذا يمكن أن يؤدي إلى تحليل الصور دون المستوى الأمثل، مع الكروية في طائرات التنسيق المختلفة. ولذلك فمن الأهمية بمكان إضافة BMM بعناية وببطء إلى كل بئر. بعد BMM بالإضافة إلى ذلك فإنه من المستحسن للتحقق من لوحةتحت المجهر وإذا اعتبر توطين غير مقبول، وهذا يمكن تداركه عن طريق الطرد المركزي لطيف. من ذوي الخبرة، وهذا نادرا ما يكون ضروريا. ومع أن هذا الأسلوب هو قوية وقابلة للتكرار للغاية، يمكن أن الاختلاف بين التجريبية تحدث مع دفعات مختلفة من BMM. لتجنب هذا، فإنه من المستحسن لشراء ما يكفي من BMM من دفعة واحدة لاستكمال سلسلة من الدراسات. وجود قيود على طريقة (كما عن أي من هذه المقايسات) هو صعوبة في التمييز بين الغزو والانتشار، والتي الخلايا السرطانية المحتمل الخضوع خلال الإطار الزمني الفحص. على الرغم من أن الوقت مضاعفة الخلايا يمكن أن تؤخذ بعين الاعتبار، أو مثبطات دورة الخلية مثل مثبط حركة الخلايا D قدم، فإنه ليس من السهل السيطرة عليها أو التمييز بين هذين الجوانب المختلفة لتطور الورم، وخاصة بالنسبة للخلايا السرطانية السريعة النمو وبالنسبة لأولئك بوضوح أن لديها أكثر &quot;توسعية&quot;، بدلا من الارتشاحي، ونمط الغزو. لهذا السببيقترح أن مواز فحص النمو 3D يتم تنفيذ لتقييم آثار محددة من أية عوامل المثبطة أو تنشيطية. إذا تم إجراء دراسات متأنية الاستجابة للجرعة، قد يكون من الممكن لتحديد تركيزات التي تقلل من الآثار المترتبة على انتشار الأسلحة النووية. على سبيل المثال لقد أظهرنا أن HSP90 المانع 17-AAG يمنع U-87 MG 3D غزو الورم كروي بالفعل في 24 ساعة وبتركيزات أقل من تركيز تثبيط نمو بنسبة 50٪ 3D (GI 50) (12). من ناحية أخرى، فإن أهمية هذا الاختبار بالمقارنة مع غيرها من المقايسات الغزو القياسية (على سبيل المثال، مرشح القائمة على فحوصات أو غزو الخلايا واحد في 3D المصفوفات 1)، هو أن الخلايا السرطانية تغزو في مصفوفة المحيطة بها من كروي، التي تمثل &quot; الورم الصغير &quot;أو&quot; ورم خبيث-الصغير &quot;، وبالتالي يأخذ بعين الاعتبار جوانب هامة من الفيزيولوجيا المرضية لكتلة الورم. طريقة نقدم يوفر معلومات عنالسلوك الجماعي من الخلايا السرطانية، عند الخروج في البداية الكروية، وأيضا بشكل فردي، عندما تصل خلايا مفردة المناطق الأكثر بعدا في BMM. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا داخل الكروية الورم قد تواجه نقص الأكسجين والمغذيات الحرمان التي، من خلال التغيرات في التعبير الجيني، يمكن أن تعزز الهجرة والغزو. هذه الميزات هي غائبة في المقايسات 2D. وعلاوة على ذلك، كل هذا هو متاح في شكل عالية الإنتاجية من خلال استخدام لوحات محددة 96-جيدا وأحدث تقنيات التصوير، والسماح لفحص 3D أكثر تعقيدا ليتم استخدامها بسهولة في التحقق من صحة الهدف واكتشاف المخدرات. طريقة نقدم يمكن أن تستوعب المزيد من التطبيقات لمعالجة جوانب إضافية من غزو الخلايا السرطانية. على وجه الخصوص، تعقيد إضافي يمكن تصور بإضافة خلايا العائل، مثل الخلايا الليفية و / أو الخلايا البطانية، إلى كروي نفسه أو المصفوفة المحيطة بها. هذا ويمكن أيضا أن يتم تعديل، ليس فقط من حيث صلابة (عن طريق استخدام شارك مختلفةncentrations من BMM)، ولكن أيضا من حيث التكوين (عن طريق إضافة مكونات أخرى تعتمد على محدد الأنسجة / جهاز من النموذج المعتمد الورم: على سبيل المثال، tenascin لسرطان الدماغ 16 و الكولاجين لسرطان الثدي 17). ويمكن أيضا مماثل مجموعة المتابعة (الجيل من الكروية والتصوير) أن تتكيف مع تقييم غزو الأنسجة في 3D، حيث الكروية الورم وشارك في تربيتها مع الهيئات مضغي تشبه الأنسجة المعقدة 12 أو مع organoids خلية محددة أخرى (على سبيل المثال، الخلايا النجمية ل مطلوب بالورم 18 أو سرداب الثقافات لسرطانات الجهاز الهضمي)، ولكن بمزيد من العمل لتمكين تحليل الصور آليا.

الكلاسيكية تنمية المضادة للسرطان المخدرات هي مركزة بشكل كبير على استخدام فحوصات في المختبر خلية القاعدة للكشف عن العوامل السامة للخلايا التي تمنع انتشار الخلايا السرطانية و / أو تعزيز موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج). وفي الآونة الأخيرة، تحركت الجهود الرامية إلى العلاجات المستهدفة مع تطوير مثبطات لأسباب الجزيئية الكامنة وراء انتشار الخلايا الخبيثة. على الرغم من بعض النتائج مذهلة، وغالبا ما ترتبط هذه العوامل مع التطور السريع للمقاومة الجراثيم للأدوية. نظرا لأنه هو احتمال الغازية والمتنقل من الخلايا السرطانية هي المسؤولة عن معظم الوفيات الناجمة عن السرطان، وهذا المرض غالبا ما انتكس يمثل النمط الظاهري أكثر عدوانية، فمن المنطقي أيضا أن تنظر مكملة في المختبر نماذج تجريبية 1،2 لتحديد رواية العوامل التي سوف تمنع هذه &#39;بصمات&#39; مفتاح إضافية من السرطان. خلال تطور خبيث، تكتسب الخلايا السرطانيةالقدرة على غزو الأنسجة المحيطة و / أو تنتشر في أعضاء بعيدة (الانبثاث). الخلايا السرطانية تخترق الغشاء القاعدي عن طريق تشكيل لinvadopodia 3،4. وأثرت هذه الهياكل مع خيوط الأكتين والبروتينات التصاق محددة وproteinases وهي مجتمعة مسؤولة عن الحركة الخلايا السرطانية وتدهور المصفوفة خارج الخلية (ECM) 5. Invadopodia تمتد إلى ECM، ويعتقد أنها مهمة لغزو الخلايا السرطانية وكذلك تسرب إلى قنوات الأوعية الدموية، مما يسهل دموي المنشأ (أو اللمفاوية) نشر والانبثاث. طرق القياسية الحالية لتقييم غزو الخلايا السرطانية في المختبر تشمل ما يلي. المستندة إلى Transwell أو بويدن المقايسات غرفة 2،6 حيث المصنف تعليق خلية واحدة على رأس مرشح مغلفة بطبقة سميكة من البروتينات المشتقة من ECM. خلايا ثم تغزو وتنتقل إلى مجلس النواب ردا على الكيماوي جاذبة. وشاع استخدام ECMالبروتينات هي من النوع الأول الكولاجين، أو قبو يشبه غشاء المصفوفة (BMM، على سبيل المثال، Matrigel، والمستمدة من الورم EHS 7) الذي يحاكي التكوين الطبيعي للأغشية الطابق السفلي. كبديل لبويدن نوع الغرفة المقايسات القائم على تصفية 8 خلايا يمكن المصنف على رأس هلام ECM (التي الليفية يمكن إضافة) حيث أنها تشكل أحادي الطبقة ومن ثم فرديا أو جماعيا غزو في هلام. ويمكن قياس الغزو من حيث عدد الخلايا الغازية و / أو المسافة المقطوعة من سطح هلام 9. ويمكن أيضا أن الخلايا السرطانية تكون جزءا لا يتجزأ تماما في مصفوفة إما تعليق خلية واحدة أو كما الكروية - عادة ما توضع بين طبقتين من ECM gel- مما يتيح لخلايا لغزو من كتلة الورم في مصفوفة المحيطة 2،6،10،11. وثلاثي الأبعاد (3D) ورم كروي مقايسة الغزو الموصوفة هنا يوفر نظام غزو automatable السريع باستخدام HIGHLذ استنساخه، طريقة موحدة 12 في شكل لوحة 96-جيدا مع كروي واحد لكل بئر. يضاف BMM مباشرة إلى كل بئر لتوفير مصفوفة شبه صلبة في الخلايا السرطانية التي تغزو من الجسم كروي. ويتم رصد مدى غزو الخلايا السرطانية على فترات على مدى فترة من 72-96 ساعة. يوفر هذا الأسلوب الميزات التالية على المقايسات الحالية في المختبر الغزو المذكورة أعلاه: الورم ويتم تنظيم الخلايا في هيكل 3D محاكاة ورم الصغرى المنطقة أو ورم خبيث الصغير؛ الأجسام الشبه الكروية الورم هي تكرار للغاية في حجم؛ يتم تنفيذ فحص الغزو في الموقع بنفس لوحة عن تطوير ورم كروي، من دون الحاجة إلى نقلها إلى لوحات الثانوية؛ طريقة، جنبا إلى جنب مع أحدث التقنيات لتحليل الصور الآلي، وتمكن كل من المحتوى العالي وتحليل إنتاجية عالية من غزو الخلايا السرطانية. يتم تنفيذ تحليل الصور باستخدام التصوير الكريات، والذي يقوم بمسح جيدا 96لوحة في غضون 10 دقيقة. باستخدام تطبيق التقاء، ومدى ومعدل الغزو يتحقق إما عن طريق خلايا مفردة أو مجموعات الخلايا تمتد من الأجسام الشبه الكروية الورم والغازية في مصفوفة يمكن قياسها بطريقة ديناميكية. لانخفاض الإنتاجية، وتقدم طريقة بديلة لتحليل الصور، استنادا إلى استخدام مجهر مقلوب وبرامج التصوير القياسية.

<table><tbody><tr><td>مصفوفة الغشاء القاعدي Corning Matrigel</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>حافظ على 4 &amp;deg;C لمنع التصلب، يتم التوزيع باستخدام رؤوس ماصات مبردة</td></tr><tr><td>مستخلص الغشاء القاعدي Cultrex، PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>حافظ على 4 &amp;deg;C لمنع التصلب، يتم التوزيع باستخدام رؤوس ماصات مبردة</td></tr><tr><td>طبق 96 بئراً فائق انخفاض الالتصاق</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>عامل نمو البشرة</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>أضف 100 &amp;mu;l 1% BSA (وزن/حجم) في الماء لـ 100 &amp;mu;g عامل نمو البشرة (EGF). إلى 25 &amp;mu;l من هذا، أضف 4,975 &amp;mu;l وسط RHB-A لإعطاء 5 &amp;mu;g/ml مخزون عامل. يتم تقسيم العينة إلى حصص وتخزينها عند درجة حرارة -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>وسط RHB-A</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>لتخفيف عامل نمو البشرة (EGF)</td></tr><tr><td>وسط ديميسو (DMEM)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>تدفئة تدريجية 37 &amp;deg;C حمام مائي قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>مصل جنين البقر</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>سخن عند 56 &amp;deg;C لإبطال فعالية المتممة قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>محلول تفكيك الخلايا</td></tr><tr><td>مقياس التدفق الخلوي Celigo</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي المراد ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بصياغته وفقًا للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة لـ JoVE.</td><td>معدات متخصصة لالتقاط الصور وتحليلها. ويُعد الالتقاط اليدوي للصور بواسطة المجهر واستخدام برنامج مستقل لتحليل الصور بديلاً لذلك.</td></tr><tr><td>مجهر IX70 المقلوب</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>غير متاح</td><td>تُستخدم مع الكاميرا لالتقاط الصور يدويًا</td></tr><tr><td>كاميرا ريتيجا إكسي فاست 1394 الرقمية (Retiga Exi Fast 1394 digital camera)</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> كيو إيمجينج (Qimaging)</a></td><td>غير متاح</td><td>مُلحق بالمجهر لالتقاط الصور يدويًا</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> سيبرنيتيكا الوسائط</a></td><td>يرجى تقديم النص المراد ترجمته.</td><td>البرنامج المستخدم للتحكم في الكاميرا والمجهر لالتقاط الصور يدويًا</td></tr><tr><td>محلل الصور Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> سيبرنيطيقا الوسائط</a></td><td>غير متاح</td><td>برنامج مستقل لتحليل الصور للقياس اليدوي لحجم الكريات العضوية</td></tr><tr><td>إكسل 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> مايكروسوفت</a></td><td>نظرًا لعدم توفر نص مصدر، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المذكورة.</td><td>برمجيات التخطيط البياني العلمي والبرمجيات الإحصائية</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>ليس لدي نص مصدر لترجمته. يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى العربية وفقاً للمعايير المحددة.</td><td>برمجيات الرسوم البيانية العلمية والتحليل الإحصائي</td></tr></tbody></table>

ثلاثي الأبعاد (3d) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

يعتبر غزو الأنسجة المحيطة العادية عموما أن تكون السمة المميزة الرئيسية للالخبيث (في مقابل حميدة) الأورام. بالنسبة لبعض أنواع السرطان على وجه الخصوص (على سبيل المثال، وأورام الدماغ مثل الأشكال ورم أرومي وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة - SCCHN) هو سبب اعتلال شديد ويمكن أن يكون حتى في حالة عدم وجود نقائل بعيدة مهددة للحياة. وبالإضافة إلى ذلك، والسرطانات التي انتكس بعد العلاج للأسف موجودة في كثير من الأحيان مع النمط الظاهري أكثر عدوانية. ولذلك، هناك فرصة لاستهداف عملية غزو لتوفير علاجات جديدة يمكن أن تكون مكملة لمضادات التكاثري القياسية. حتى الآن، وقد أعاق هذه الاستراتيجية من خلال عدم وجود قوية، المقايسات استنساخه مناسبة لإجراء تحليل مفصل للغزو وفحص المخدرات. نحن هنا نقدم طريقة لوحة صغيرة بسيطة (على أساس موحد، الكروية الورم 3D الذاتي تجميع) التي لديها إمكانات كبيرة لمثل هذا ستويموت. نحن مثالا على منصة الفحص باستخدام خط خلية ورم أرومي البشري وأيضا نموذجا SCCHN حيث يرتبط تطور المقاومة ضد تستهدف عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR) مثبطات مع تعزيز مصفوفة الغازية المحتملة. كما نقدم طريقتين بديلة للالكمي شبه الآلي: واحد باستخدام التصوير الكريات والثانية التي يتطلب ببساطة القياسية المجهري والتقاط الصور مع تحليل الصور الرقمية.

ويتم تقييم 3D غزو الورم كروي باستخدام، قابلة للتكرار، طريقة بسيطة الآلي موضح تخطيطي في الشكل 1: يتم الحصول عليها الكروية الورم الحجم بتكاثر بواسطة طلاء الخلايا في ULA 96-جيدا لوحات أسفل مستديرة. هي جزء لا يتجزأ 4 أيام بعد بدء-الكروية في BMM. وهذا يوفر بنية شبه صلبة في الخلايا السرطانية التي تغزو وتنتشر كروي. وتقع الكروية مركزيا في قاعدة كل بئر والغزو في BMM يتم رصدها بسهولة على فترات بدءا من ر = 0 تصل إلى 72-96 ساعة باستخدام التصوير الكريات. هذا يمكن أن توفر تحليل الصور مؤتمتة بالكامل. ويوضح أمثلة لأنواع مختلفة من غزو الخلايا السرطانية في أرقام 2 - 4 خبيث للغاية الأشكال ورم أرومي الإنسان (GBM) خط الخلية U-87 MG، يشكل ضيق، كروية هيكل 3D، ويستخدم هنا مثالا أورام المخ التي محلية الغزو هو مهددة للحياة على الرئيسيةالميزة. مرة واحدة جزءا لا يتجزأ من BMM، الخلايا من الكروية U-87 MG تنتشر مع &quot;النجمي&quot; نمط الغزو نموذجي 12. الخلايا السرطانية تمديد شعاعيا في مصفوفة التي تحافظ على شكل 3-الأبعاد. ويتبع عملية على مدى 72 ساعة كما هو مبين في الشكل رقم 2 لU-87 MG الكروية، عندما مدى غزو الخلايا السرطانية، مع تفاصيل العمليات الخلوية وinvadopodia تمتد إلى BMM هو واضح بشكل واضح. مؤتمتة بالكامل تحليل الصور باستخدام صورة الكريات تمكن الكميات الدقيقة للغزو الخلايا السرطانية مع مرور الوقت. يتم الحصول على القياس الكمي في الشكل 2 كما هو موضح في الشكل رقم 1، حيث ينتج عن التحليل الآلي تجزئة حول نتوءات خلية تمتد إلى BMM من U-87 MG جسم كروي. لاحظ أن لهذا الخط خلية، يتم استبعاد لهيئة كروي الورم من قياس مجال غزو. وهناك نمط مختلف من invasتم عرض أيون الحرشفية في الرأس والرقبة خطوط الخلايا السرطانية البشرية. CAL S وCAL R هي إسوي لكن CAL S حساس ل، وCAL R مقاومة للEGFR التيروزين كيناز مثبطات 14. في غياب EGF، لا خط الخلية غزا في BMM (الشكل 3) ومع ذلك، كما تم زيادة تركيز EGF (2.5 نانوغرام / مل)، تظهر الكروية إلى &quot;برعم&quot;. في تركيزات أعلى من EGF (40 و 80 نانوغرام / مل) درجة الغزو تم تخفيض. وهذا يتفق مع الكلاسيكية على شكل جرس الاستجابة للجرعة لEGF من حيث الغزو التي ذكرت سابقا 15. في 20 نانوغرام / مل EGF، كانت نتوءات تشبه الاصبع مقذوف من الجسم الرئيسي للالكروية CAL R بينما الخلايا CAL S أقل الغازية بعد 72 ساعة (الشكل 3). وكان هذا الغزو الفرق واضح 48 ساعة بعد وضعت الكروية في BMM (تحتوي على 20 نانوغرام / مل EGF للتميز القصوى بين خطوط الخلايا) وأعظم بعد 72 ساعة (الشكل 4). تم الحصول عليها هذه الصور بسرعة باستخدام التصوير الكريات، أما بالنسبة U-87 MG. ومع ذلك، في هذه الحالة، لتجسد أسلوب بديل، وكان كميا درجة غزو يدويا باستخدام برمجيات تحليل الصور قائمة بذاتها ويتم عرضها بيانيا (الشكلان 3 و 4). وتوضح هذه النتائج فرق المظهري بين الخلايا الحساسة للعقاقير ومقاوم يمكن استخدامها للكشف عن المركبات التي سوف يثير عداء على وجه التحديد مقاومة، النمط الظاهري الغازية المخدرات. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> الشكل 1. نظرة عامة تخطيطي 3D الورم كروي الغزو الفحص. ويوضح سير العمل الخطوات ينطوي على طريقة بما في ذلك الصور ممثل الكروية U-87 MG ورم أرومي بعد التضمين في BMM (اللوحة العلوية؛ ر = 0) وبعد الغزو<html> في BMM (اللوحة السفلية؛ ر = 72 ساعة) مع وبدون تجزئة الذي يقيس المنطقة من قبل الخلايا الغازية تغطيتها. بار = 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> الشكل 2. الوقت بالطبع من الغزو U-87 MG ورم أرومي كروي في BMM. U-87 MG كروي تم رصد الغزو 3D في BMM وكميا تصل إلى 72 ساعة باستخدام التصوير الكريات. (A) صور الممثل و (B) الكمي ل وترد غزو الخلايا السرطانية. بار = 500 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> إعادة 3 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; ويبين الشكل 3. CAL R (مقاومة) وCAL S (حساسة) غزو الورم كروي. (A) صور الممثل و (B) الكمي اليدوي للEGF تعتمد على الجرعة CAL R وCAL S غزو الورم كروي. بار = 500 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> الرقم 4. خلايا من CAL R (المقاومة) الكروية هي أكثر الغازية من CAL S (الحساسة) الكروية الورم عند وضعه في BMM. وعند تبين التحفيز EGF CAL R الكروية ورم غزو أكثر وضوحا من CAL S. (A) صور الممثل و (B) الكمي اليدوي للغزو ترد. بار = 500 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

غزو الأنسجة الطبيعية المحيطة هو سمة مميزة للأورام الخبيثة. نقدم هنا اختبارا بسيطا وشبه آليا للوحة الدقيقة للغزو في مصفوفة حيوية ثلاثية الأبعاد طبيعية تم تجسيدها بعدد من نماذج السرطانات البشرية المتقدمة.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير مقايسة مخبرية شبه مؤتمنة ثلاثية الأبعاد باستخدام أطباق ميكروية لقياس غزو الخلايا الورمية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنتاج كتل ورمية ذات أحجام قابلة للتكرار في حالة تعليق داخل أطباق ذات 96 بئراً ذات قاع مستدير ومنخفضة الالتصاق للغاية، بحيث توجد كتلة ورمية واحدة في كل بئر. وتتمثل الخطوة الثانية في إزالة أجزاء من الوسط وإضافة مادة تشبه الغشاء القاعدي أو BMM مباشرة إلى كل بئر لتوفير مصفوفة شبه صلبة تغزوها الخلايا الورمية انطلاقاً من جسم الكتلة الورمية.بعد ذلك، يتمت مراقبة غزو الكريات الورمية على فترات زمنية خلال مدة تتراوح من 72 إلى 96 ساعة، يتم خلالها الحصول على الصور إما تلقائياً باستخدام مقياس التدفق الخلوي أو يدوياً باستخدام المجهر. الخطوة النهائية هي تحليل غزو الخلايا الورمية إما من خلال مقياس تدفق خلوي آلي أو برنامج تحليل الصور. وفي النهاية، يُستخدم مقايسة غزو الكريات الورمية ثلاثية الأبعاد لنمذجة غزو السرطان في المختبر (in vitro) بتنسيق أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية وقابلية للتطبيق في دراسات التحقق من الأهداف وفحص الأدوية.نحن نؤمن بأن هذه التقنية مكملة لمقاييس تكاثر الخلايا ثنائية الأبعاد البسيطة المستخدمة عادةً للتحقق من الأهداف وفحص الأدوية في أبحاث السرطان، لأنها تمكننا أيضاً من دراسة الغزو، وهو جانب رئيسي من تطور السرطان في تنسيق ثلاثي الأبعاد ذي صلة من الناحية الفسيولوجية. لقد خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قمت بتحسين طور الورم ثلاثي الأبعاد، والنمو في الأطباق الدقيقة. واعتقدت أنه سيكون من الجيد استخدام نفس الإعداد والنظر أيضاً في الغزو، وكانت النتيجة بسيطة، وهي مجرد إزالة جزء من الوسط من كل بئر واستبداله بمصفوفة شبيهة بالغشاء القاعدي.يعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة أمراً ضرورياً، حيث إن الحفاظ على الاسترويدات في موضع مركزي داخل كل بئر بعد نقل BMM قد يكون صعباً في البداية. وقد يؤدي ذلك إلى تحليل غير مثالي للصور نظراً لوجود الاسترويدات في مستويات بؤرية مختلفة. ومع اكتساب الخبرة.يحدث هذا نادراً، ولكن إذا لزم الأمر، يمكن تسهيل العملية من خلال إجراء طرد مركزي خفيف للصفيحة. لبدء تحضير جميع أوساط BMM على الثلج طوال الليل، احتفظ بمجموعة من رؤوس المرشحات المعقمة لماصات P 10 E 200 و P 1000 وأنابيب معقمة في درجة حرارة -20 °C. ضع أيضاً صفائح 96 بئراً ذات الالتصاق المنخفض للغاية والتي تحتوي على ستيرويدات عمرها أربعة أيام على الثلج.باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة 100 µL من وسط النمو من كل بئر في أطباق sparrow برفق. في هذه الخطوة، وجّه طرف الماصة نحو الجدار الداخلي للقاع الذي يتخذ شكل حرف U. تجنب تماماً ملامسة قاع البئر أو موقع الـ sphe.لتقليل اضطراب الستيرويدات باستخدام رؤوس ماصات مبردة بالثلج، يتم نقل خلايا BMM إلى أنابيب مبردة بالثلج. وفي دراسات الغزو المحفز بالسيتوكينات أو دراسات تقييم الأدوية، تضاف الكواشف إلى خلايا BMM باستخدام رؤوس ماصات مبردة بالثلج. فعلى سبيل المثال، يُستخدم عامل نمو البشرة أو EGF لتحفيز غزو خلايا سرطان الخلايا الحرشفية Cal S و cal r.ثم قم بتوزيع 100 µL من وسط BMM برفق داخل البئر، مع توجيه طرف الماصة نحو الجدار الداخلي للبئر. تعد هذه الخطوة الأكثر أهمية.أما بالنسبة لتحليل الصور الضوئية، فيجب أن تظل الستيرويدات في مركز البئر. كرر هذه الخطوة لجميع الآبار المطلوبة، مع السماح بخمس إلى ست مكررات لكل حالة. إذا لزم الأمر، استبدل الطرف بطرف آخر مبرد حديثًا باستخدام إبرة معقمة.قم بإزالة الفقاعات في حال وجودها. استخدم المجهر للتحقق بصرياً من وجود الستيرويدات في وضع مركزي؛ وإذا لم تكن كذلك، قم بمركزة الطبق بسرعة 300 ×g لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C. سيضمن ذلك تمركز الستيرويدات في منتصف كل بئر.بعد ذلك، انقل الطبق إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية واترك BMM يتصلب بعد ساعة واحدة. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 microliters لكل بئر من وسط نمو كامل، أو دراسات الغزو المحفزة بالسيتوكينات أو دراسات تقييم الأدوية.أضف السيتوكينات أو المثبطات إلى الوسط من أجل الحصول على الصور بشكل آلي. قم بمسح الأطباق باستخدام مقياس التدفق الخلوي على فترات زمنية محددة. ابدأ من الوقت صفر، ثم اختر تطبيق درجة الالتحام (confluence).ثم تحقق من أن الستيرويد في بؤرة التركيز. إذا لزم الأمر، اضبط التركيز يدويًا وثبّت إزاحة التركيز. تحت إعدادات أخذ العينات.قم بمسح حقل رؤية مركزي واحد باستخدام المحدد. بعد إضافة BMM، يجب أن تظل الستيرويدات الورمية في موقع مركزي. وبذلك، لا توجد حاجة لمسح البئر بالكامل في البرنامج.حدد الآبار المراد مسحها عن طريق تظليلها في خريطة الطبق. ثم انقر على بدء المسح. ولإجراء تحليل تلقائي للصور، اختر تطبيق الالتحام (confluence application).في علامة تبويب التحليل، قم بتعديل إعدادات التطبيق لإنتاج تقسيم دقيق حول الجسم الكروي، بما في ذلك الاستطالات الخلوية وأقدام الغزو الممتدة إلى داخل غشاء القاعدة (BMM). قم بتعديل الإعدادات لكل خط خلوي ورمي أو في نقاط زمنية مختلفة. تحقق من أن إعدادات التحليل مناسبة للأجسام الكروية الأخرى في الطبق من خلال النقر على عدة آبار مختلفة.إذا لم يحدد التقسيم حدود الستيرويد بدقة، فقم بتعديل إعدادات التطبيق بشكل أكبر. انقر فوق "بدء التحليل" (start analysis) في علامة تبويب النتائج. افحص عدة آبار للتحقق من جودة التحليل قبل تصدير بيانات مستوى البئر إلى برنامج جداول بيانات.كرر التحليل لجميع النقاط الزمنية، ثم احسب متوسط النسبة المئوية للاندماج (confluence) للآبار المكررة وعلاقة الغزو بالزمن في مخطط أعمدة. وباستخدام برمجيات الرسم البياني العلمي والتحليل الإحصائي المختارة لالتقاط الصور يدويًا، استخدم مجهرًا مقلوبًا مجهزًا بعدسة شيئية 10x لتسجيل صورة لكل كروية ورمية (tumor spheroid) على فترات زمنية، بدءًا من T = 0 وصولًا إلى ما بين T = 72 و 96 ساعة.اعتماداً على سرعة غزو البطانة الخلوية المعنية، استخدم عدسة شيئية Forex عندما تكون المنطقة المغزوة كبيرة جداً بحيث لا يمكن التقاطها بالكامل ضمن مجال الرؤية 10 x. احفظ كل صورة فردية تم الحصول عليها من أجل تحليل الصور يدوياً. افتح صور رسوم المنصة في تحليل التصوير.البرنامج المختار للمعايرة هو images of a stage graphe taking. باستخدام العدسات الشيئية 10 x و 4 x. أدخل القياسات الرسومية، والوحدات، والعدسات الشيئية المستخدمة، ثم قم بإجراء المعايرة.هذه الخطوة مطلوبة مرة واحدة فقط لتحليل الصور اللاحق. ببساطة، قم بإعادة تحميل إعدادات المعايرة المطلوبة. بعد ذلك، افتح صور مقايسة الغزو واختر إعدادات المعايرة بناءً على عدسة المجهر الشيئية المستخدمة للحصول على الصور.قم بقياس المساحة التي تغطيها الستيرويدات باستخدام البرنامج المستخدم هنا. انتقل إلى قائمة القياس (measure) واختر "حساب الحجم" (count size). اختر "بينما" (while) ثم قم بتحميل الإعدادات واختر إعدادات المقايسة المحددة مسبقاً.ثم اختر "count" (العد). يجب بعد ذلك تقسيم الستيرويد بدقة. قم بتصدير القياسات، وهي معاملات مختلفة، إلى جدول بيانات، وسجل معلومات الصورة ذات الصلة في جدول البيانات.وأخيراً، قم برسم مخطط لمساحة المتوسط للستيرويدات المكررة أو الغزو مقابل الوقت باستخدام برامج الرسم البياني العلمي والبرمجيات الإحصائية. يظهر هنا كمثال على غزو الخلايا السرطانية الملاحظ في خط خلايا الورم الأرومي الدبقي U 87 MG، والذي يمكن استخدامه لتوضيح غزو أورام الدماغ. وبمجرد انغراسها في خلايا BMM، تنتشر الخلايا بنمط غزو نجمي نموذجي، حيث تتم متابعة هذه العملية على مدار 72 ساعة.تحليل صوري مؤتمت بالكامل. ينتج عن استخدام مقياس التدفق الخلوي الصوري (image cytometer) تحديد تقاسيمي حول بروزات الخلية، مما يتيح قياساً كمياً دقيقاً لغزو الخلايا الورمية. يُلاحظ أنه بالنسبة لهذا الخط الخلوي، يتم استبعاد الجسم الستيرويدي من قياس المنطقة المغزوة.يمكن إجراء تحليل الصور المؤتمت بالكامل بسهولة، وهو يوفر قياساً كمياً لغزو الخلايا الورمية بمرور الوقت. يظهر نمط مختلف من غزو الخلايا في الخلايا الحرشفية البشرية المتماثلة جينياً من الرأس والرقبة. وتعد الخطوط الخلوية السرطانية Cal S حساسة لمثبطات تيروزين كيناز EGFR، بينما تعد CAL R مقاومة لها.في حالة غياب EGF، لم تغزُ أي من السلالتين الخلويتين مصفوفة BMM، أما في وجود EGF فقد برزت نتوءات تشبه الأصابع من الجسم الرئيسي لـ Cal ars steroids. وبينما كانت خلايا Cal s أقل قدرة على الغزو بعد 72 ساعة، فقد تم الحصول على الصور في هذه الحالة بسرعة باستخدام مقياس التدفق الخلوي التصويري (image cytometer)، ولتوضيح طريقة بديلة، تم قياس درجة الغزو يدويًا باستخدام برنامج مستقل لتحليل الصور. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن كل سلالة خلوية تتطلب تحسينًا لضمان قدرتها على تكوين الـ steroids، وكثافة استزراع الخلايا، وتكوين المصفوفة، وإعدادات التصوير والتحليل. بعد هذا الإجراء، يمكن تكييف الطريقة ذاتها لتقييم غزو الأنسجة ثلاثية الأبعاد باستخدام، على سبيل المثال، الأورام في مستنبت مشترك مع أجسام جنينية لمحاكاة نسيج معقد أو عضويات أخرى مثل الخلايا النجمية للغليوما أو مستنبتات الخبيئات لسرطانات الجهاز الهضمي، أو الكبد لسرطان الخلايا الكبدية وانتشار سرطان القولون.

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

يوصف لفحص لقياس كميا تحويل عامل النمو (TGF) - β بفعل الغزو في المواد الهلامية الكولاجين 3 الأبعاد. هذا الاختبار يستفيد من سلسلة MCF10A من خطوط الخلايا التي تمثل مراحل مختلفة من تطور مرض السرطان الثدي. ويمكن اعتماد هذه الطريقة ليتم استخدامها مع خطوط الخلايا الأخرى ، ويمكن استخدامها لتفعيل التحقيق المحتملين الآخرين أو مثبطات الغزو.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

يوضح هذا الفيديو طريقة لإنشاء ثقافة كروية ثلاثية الأبعاد للورم والخلايا التائية. يتم تحضير قالب الاغاروز مع الآبار الصغيرة التي تحتوي على كرويات الورم ، تليها إضافة الخلايا التائية. بعد الحضانة ، يسمح هذا الإعداد بدراسة تفاعل الخلايا التائية مع الكرويات السرطانية في بيئة ثلاثية الأبعاد خاضعة للرقابة.

نموذج الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد للخلايا التائية المتسللة في الورم الكروي

المصدر: Guyon, J., et al. نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للورم الأرومي الدبقي. J. Vis. Exp. (2020) يوضح الفيديو إنشاء نموذج كروي ثلاثي الأبعاد لغزو الخلايا السرطانية. تتكون الكرات الكروية من خلايا ورم الدماغ البشري ومدمجة في مصفوفة الكولاجين. تتبنى الخلايا السرطانية في المحيط الكروي نمطا ظاهريا غازيا ، وتفرز البروتياز لتحلل الكولاجين وتتقدم لغزو المصفوفة المحيطة.

توليد نموذج كروي ثلاثي الأبعاد لغزو الخلايا السرطانية

تقوم هذه الطريقة بتقييم غزو الخلايا السرطانية من الكرات إلى مصفوفة ثلاثية الأبعاد محيطة.  يتم إنشاء الكرات الكروية عبر طريقة زراعة القطرات المعلقة ثم يتم تضمينها في مصفوفة تتكون من مواد الغشاء القاعدي والكولاجين من النوع الأول.  يتم مراقبة الغزو من الكرويات لاحقا.

خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D

وتمثل العمليات التي تحكم غزو سرطان المثانة فرصاً للعلامات البيولوجية والتنمية العلاجية. هنا نقدم نموذجا غزو سرطان مثانة الذي يتضمن الثقافة ثلاثي الأبعاد من الماغنيسيوم الورم والوقت الفاصل بين التصوير والفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الأسلوب مفيد لتحديد ملامح عملية الغازية وفحص العوامل العلاجية.

نظام الثقافة خلية ثلاثية الأبعاد لدراسة الغزو وتقييم المداواة في سرطان المثانة

البيئة المجهرية للورم جزء أساسي من نمو السرطان والغزو. لمحاكاة تقدم السرطان ، هناك حاجه إلى مصفوفة بشريه ذات صله بيولوجيا. يقدم هذا البروتوكول تحسينا لاختبار الغزو كروي ثلاثي الابعاد في المختبر من خلال تطبيق مصفوفة قائمه علي الورم العضلي البشري. ويقدم البروتوكول أيضا تحليلا للغزو الخلوي القائم علي الحاسوب.

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج 3D في المختبر لدراسة التمايز بين الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) في بيئة تشبه الورم السائبة، والتي يمكن معالجتها في أنظمة التحليل المختلفة، مثل الفلورة المناعية، النسخ التحليل وتصوير خلايا الحياة.

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

هنا، نحن نصف سهل الاستخدام غزو القول للورم الأرومي الدبقي. هذا القول مناسب للخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي. كما يتم وصف ماكرو فيجي لسهولة تقدير كمية الغزو والهجرة والانتشار.

نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للورم الأرومي الدجلي

النهج المقدم في وقت واحد يقيم غزو الخلايا السرطانية في 3D مقايسات كروية وT-خلية السمية الخلوية. يتم إنشاء Spheroids في جبيرة agarose متعددة microwell خالية من السقالات. يتم تنفيذ ثقافة المشاركة والتضمين في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول داخل نفس الجهاز الذي يسمح بمراقبة غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية بوساطة T-cell.

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

هنا هو بروتوكول لتصنيع جهاز التصوير spheroid. هذا الجهاز يتيح دينامية أو تصوير الفلورية طولية من الخلايا السرطانية spheroids. كما يقدم البروتوكول إجراء بسيط لمعالجة الصور لتحليل غزو الخلايا السرطانية.

الوقت تحليل التصوير الفلوري وتحليل غزو الخلايا السرطانية في نموذج 3D Spheroid

الغزو هو ظاهرة بيولوجية رئيسية في تطور وتطور السرطان. تتأثر هذه العملية بالخلايا غير الورمية ومكونات البيئة المكروية للورم. الغرض من هذه الدراسة هو وصف طريقة بديلة لتحليل غزو الخلايا السرطانية في المختبر باستخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D).

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

تعلم تقييم غزو الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد باستخدام مصفوفة شبيهة بالغشاء القاعدي. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة سلوك الأورام في بيئة فيزيولوجية واقعية وتسريع اختبار الأدوية.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

استكشف المزيد من الفيديوهات