المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار بروتوكول بسيط لعزل العدلات أو المصائد خارج الخلية أو الشباك من الدم البشري الكامل باستخدام الكواشف المتاحة بسهولة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل العدلات أولا عن الدم البشري الكامل ، باستخدام تقنية الطرد المركزي التفاضلية كخطوة ثانية. يتم تحفيز العدلات المعزولة باستخدام PMA للحث على تكوين الشبكة ، ويسمى أيضا NETosis.

بعد ذلك ، يتم تحضير صفيحة بعزل شبكي خال من الخلايا وتضاف الخلايا السرطانية لتوضيح كيفية تأثير الشباك على التصاق الخلايا. تظهر النتائج أن إضافة طبقة أحادية الشبكة تعمل على تحسين التصاق 5 49 خلية سرطانية وأن هذا الالتصاق ينخفض عندما تتحلل الشباك. يعد استخدام DNAS واحد عرضا مرئيا لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية.

بالنظر إلى حداثة هذه التقنية ، فإن التعامل مع المصائد الخلوية xor العدلات ، فإن الشباك صعبة للغاية نظرا لمدى هشاشة هذه الهياكل. للبدء ، احصل على 80 مل من الدم البشري الكامل الطازج في 14 أنبوبا علويا أخضر هيبارين كما هو موضح في بروتوكول النص. افتح كل أنبوب وأضف خمسة ملليلتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم إلى كل أنبوب.

بعد ذلك ، أضف 15 مل من وسائط فصل الخلايا الليمفاوية أو LSM في كل من أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر في درجة حرارة الغرفة. ثم استخدم إبرة قياس 18 مثبتة على حقنة سعة 60 مليلتر لوضع طبقة من الدم المخفف بعناية على LSM ، مما يؤدي إلى إنشاء جهاز طرد مركزي حاد لواجهة الدم LSM للأنابيب عند 800 مرة G لمدة 30 دقيقة عند 21 درجة مئوية دون كسر لإيقاف جهاز الطرد المركزي ، واستنشق بعناية والتخلص من الطبقتين السائلتين العلويين والواجهة بينهما ، تاركا الطبقة الحمراء السفلية فقط. تحتوي هذه الحبيبات على كريات الدم الحمراء والعدلات.

أضف 20 مل من PBS و 20 مل من محلول ديكستران 6٪ لكل أنبوب. اقلب كل أنبوب برفق واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. سوف تترسب خلايا الدم الحمراء في قاع الأنبوب.

بعد ذلك ، انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة وتخلص من المنصات. قم بالطرد المركزي للطاقات عند 450 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية ، تاركا الحبيبات الغنية بالعدلات. تحضير محلول التحلل مع 0.5 مل من محلول التحلل في 4.5 مل من الماء المعقم.

أضف ما مجموعه خمسة ملليلتر من محلول التحلل إلى كل أنبوب وقم بتجميع كل الكريات في قارورة واحدة. ضع القارورة في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لقمل أي خلايا دم حمراء متبقية. الطرد المركزي للعدلات عند 450 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بخمسة ملليلتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 450 مرة G عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على محلول التحلل المتبقي. أعد تعليق حبيبات العدلات في 30 مل من وسط RPMI البارد المكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 3٪ ، وضع الأنبوب على الجليد لتحفيز تكوين مصائد أو شبكات خارج الخلية للعدلات.

أضف 500 نانو مولار من PMA إلى 30 لترا من معلق العدلات في طبق زراعة أنسجة مسطحة مقاس 150 ملم × 25 ملم. باستخدام شبكة 20 ملم ، احتضان الخلايا لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، قم بالشفط برفق والتخلص من الوسط ، مع الحرص على عدم تعطيل طبقة الشباك والعدلات التي تلتصق بقاع الطبق.

ثم استخدم ماصة لغسل قاع كل طبق ب 15 مل من PBS البارد بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، ويجب إزالة جميع المواد الملتصقة من القاع. اجمع معلق الغسيل في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ثم جهاز الطرد المركزي عند 450 مرة G لمدة 10 دقائق. عند أربع درجات مئوية ، سوف تنتشر العدلات وأي خلايا متبقية في الأسفل.

ترك صافي غني بالخلايا الطافي بعد ذلك ، صب المادة الطافية في أنابيب متعددة سعة 1.5 مليلتر وأجهزة الطرد المركزي عند ثمانية 18،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لحبيبات الحمض النووي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في PBS بحيث يتوافق التركيز مع اثنين في 10 إلى العدلات السابعة لكل 100 ميكرولتر من PBS. يمكن استخدام هذا المخزون الصافي الخالي من الخلايا في التجارب اللاحقة.

قياس تركيز الحمض النووي للعينة باستخدام القياس الضوئي الطيفي. يجب أن يتراوح التركيز الكافي بين 140 و 180 نانوغرام لكل ميكرولتر عند 100 ميكرولتر من المخزون الصافي في كل بئر من صفيحة قاع مسطحة 96 جيدا واحتضان اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية في الظلام لتغطية الآبار بعد 12 إلى 20 ساعة ، استخدم مجهرا للتحقق من تكوين طبقة أحادية موحدة من الشباك الخالية من الخلايا في قاع الآبار. بمجرد التحقق من الطبقة الأحادية ، قم بشفط جميع المواد غير الملتصقة برفق من الآبار.

تأكد من عدم تعطيل الطبقة الأحادية في الأسفل. هذا هو الجانب الأكثر تحديا في هذا الإجراء. من أجل الحفاظ على طبقة أحادية شبكية كافية ، عليك التعامل مع اللوحة بعناية فائقة.

أضف جميع الكواشف والخلايا ببطء على جانب الآبار ، واستنشق برفق شديد ، وتجنب لمس قاع البئر بطرف شفط. مع إزالة المادة غير الملتصقة ، أضف برفق 100 ميكرولتر من محلول منع ألبومين مصل الأبقار بنسبة 1٪ لكل بئر واتركه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لا تقم بتقليب اللوحة أو هزها لأن ذلك قد يعطل الطبقة الأحادية الصافية.

بعد ذلك ، قم بإعداد 5 49 خلية سرطانية عن طريق حصادها عندما تكون متقاربة بنسبة 70 إلى 80٪. باستخدام التقنيات القياسية ، أعد تعليق الخلايا في الوسط بتركيز مرتين في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل 100 ميكرولتر. تلطيخ الخلايا عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من CFS e لكل مليلتر من الوسط ، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في الحجم الأولي للوسط للحفاظ على تركيز مرتين في 10 إلى الخلايا السرطانية الرابعة لكل 100 ميكرولتر من الوسط. خذ اللوحة المطلية بالشبكة واستنشق محلول الحظر برفق.

ثم أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية إلى كل بئر واترك الخلايا تلتصق بالصفيحة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لشفط السائل بالكامل وأضف 1000 وحدة من الحمض النووي ، واحد إلى بعض الآبار لمدة 10 دقائق لتحلل الشباك في الآبار الأخرى. أضف 100 ميكرولتر من الماء المعقم لكل بئر لمدة 10 دقائق كتحكم في السيارة. بعد ذلك ، قم بشفط السائل برفق من كل بئر واغسله ب 100 ميكرولتر من PBS لإزالة أي مادة غير ملتصقة.

A 5 49 خلية تستنشق وتتخلص من جميع المحاليل في الآبار ، تاركة فقط الشباك والخلايا السرطانية الملتصقة في الأسفل. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ لكل بئر لإصلاح الخلايا ، ونقل اللوحة على الفور إلى مجهر مضان لقراءة الفحص ثم رسم النتائج وتحليلها. باستخدام برنامج تحليل البيانات.

تم استخدام الشبكات الخالية من الخلايا في فحوصات الالتصاق الساكنة مع 5 49 خلية سرطانية. أظهر الفحص المجهري الضوئي أن الخلايا السرطانية تلتصق بشدة بالطبقة الأحادية الصافية. في المختبر.

انخفض هذا الالتصاق بعد أن تدهورت الطبقة الأحادية الصافية بواسطة الحمض النووي المجهري الفلوري للعلامة 5 49 خلية سرطانية أكدت هذه النتائج. تم تحديد ارتباط 5 49 خلية بالطبقة الأحادية الصافية عن طريق حساب عدد الخلايا لكل مجال طاقة عالية. كما هو موضح هنا ، لم يكن هناك تغيير في التصاق الخلايا السرطانية بالشبكات في التحكم في السيارة.

ومع ذلك ، كان هناك انخفاض كبير في التصاق الخلايا السرطانية بالشبكات في وجود الحمض النووي واحد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية عزل الشباك والتعامل معها من دم الإنسان الكامل. يمكن بعد ذلك استخدام هذه العزلات الشبكية الخالية من الخلايا في مجموعة متنوعة من التقنيات ، بما في ذلك التألق المناعي ، والفحص المجهري متحد البؤر ، والمجهر الإلكتروني ، والنشاف الغربي.