إنتاج وتوصيف والمحتملة استخدامات الأنسجة المهندسة-3D الإنسان المريء المخاطي نموذج

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج نموذج هندسي ثلاثي الأبعاد للأنسجة لظهارة المريء البشرية لاستخدامه كمنصة تجريبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا الليفية المريئية البشرية الطبيعية والخلايا الظهارية من عينات أنسجة المريء البشرية. في الخطوة الثانية ، يتم زرع الخلايا الليفية على خلية ظهارية ، وعلامة مسام ، وسقالة مريء ، ويتم زراعتها لمدة سبعة أيام.

بعد ذلك ، يتم قلب السقالة وتضاف الخلايا الظهارية للمريء البشرية المعزولة إلى المزرعة لمدة أربعة أيام. في الخطوة الأخيرة ، يتم نقل النموذج إلى واجهة سائل الهواء لمدة خمسة أيام أخرى من الثقافة ، مما يسمح بتطور ظهارة طبقية ناضجة. في النهاية ، يتم استخدام الكيمياء المناعية لتوصيف العلامات الرئيسية للتكاثر والتمايز التي تعبر عنها الخلايا الظهارية النموذجية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية في أنها تسمح للخلايا بالحصول على تفاعلات مصفوفة الخلية والخلية التي سيكون لها في الجسم الحي. وباستخدام هذه التقنية، يمكننا إنتاج ظهارة حرشفية طبقية ناضجة تشبه المريء الطبيعي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لثلاثة أسباب.

أولا ، قد يكون من الصعب التأكد من أن غالبية الخلايا الظهارية لا تتمايز قبل تضمينها في السقالة. ثانيا ، يجب توخي الحذر لضمان توفير الواجهة الصحيحة لسائل الهواء خلال الفترة التي تنضج فيها الظهارة. وثالثا ، يمكن أن يكون من الصعب الحفاظ على الثبات طوال فترة الثقافة.

لعزل الخلايا الظهارية للمريء البشرية ، ضع الأنسجة المخاطية الحرشفية للمريء المحصودة في طبق بتري معقم واستخدم مشرطا معقما بالإيثانول لتقطيع الأنسجة إلى شرائح 0.5 سم. ثم احتضان الأنسجة في 0.1٪ tryin مغطاة عند 37 درجة مئوية ، وإيقاف الهضم بعد ساعة بخمسة ملليلتر من FCS. بعد ذلك ، أمسك الشرائط بالملقط ، اكشط السطح الظهاري برفق بشفرة المشرط لمدة دقيقة إلى دقيقتين لكل شريط لإزالة الخلايا الظهارية إلى الوسط المحيط عندما يتم كشط جميع الشرائط ، ونقل الوسط الذي يحتوي على الخلايا الظهارية المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.

بعد تدوير الخلايا ، تخلص من السنا وأعد تعليق الحبيبات في 12 مل من الوسط الظهاري. ثم تخلص من الوسط من مزرعة الخلايا المقيدة واستخدم ماصة معقمة لصفيحة الخلايا الظهارية على الخلايا المغذية لعزل الخلايا الليفية للمريء البشرية. انقل شرائح الأنسجة المكشطة إلى طبق بتري معقم ، وأخيرا افرم الأنسجة بالمشرط.

هضم القطع في 10 مل من 0.5٪ كولاجيناز محلول مغطى بدرجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع جو رطب طوال الليل. في اليوم التالي ، انقل الهضم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وقم بتدوير الخلايا. تعليق الحنك في 10 ملليلتر من ثقافة الخلايا الليفية متوسطة.

الثقافة في قارورة T 75 في حاضنة زراعة الخلايا. لتحضير سقالات المريء منزوعة الخلايا ، ابدأ باستخدام المقص وزوج من الملقط لقطع مريء الخنزير طوليا. بعد ذلك ، اغسل المريء في وعاء معقم سعة 180 مليلتر يحتوي على 100 مل من PBS المعقم لمدة 10 دقائق مع رج لطيف لإزالة أي بقايا يومية أثناء شطف الأنسجة.

رش لوح تشريح الفلين بنسبة 70٪ من الإيثانول عندما يجف الفلين في المريء على اللوح مع رفع الجانب المخاطي. الآن ، استخدم ملاقط معقمة لإمساك السطح المخاطي في أحد طرفي المريء وسحب الأنسجة بعيدا عن اللوح لفصل الغشاء المخاطي عن الغشاء المخاطي الأساسي. ثم باستخدام شفرة مشرط معقمة ، قم بتشريح المريء طوليا على طول lanar propria ، وقم بإزالة المسامير مع تقدم التشريح للسماح برفع الغشاء المخاطي بعيدا.

تخلص من الغشاء المخاطي السفلي واستخدم مشرطا لتقطيع الغشاء المخاطي المتبقي إلى قطع مربعة خمسة سنتيمترات. اغسل القطع في 150 مل من PBS المعقم مع تحريك لطيف كما هو موضح للتو. بعد خمس دقائق ، انقل الأنسجة إلى وعاء سعة 180 مليلتر يحتوي على 150 مل من محلول كلوريد الصوديوم المولاري.

يستكمل بالمضادات الحيوية عند 37 درجة. بعد 72 ساعة ، انقل الأنسجة إلى 150 مل من PBS المعقم ، وعند هذه النقطة ستبدأ الظهارة في الانفصال بشكل واضح عن الأنسجة الأساسية. استخدم ملقطا معقما وشفرة مشرط لإزالة الظهارة المنفصلة ووضع الأنسجة المتبقية في وعاء جديد من 150 مل من PBS المعقم مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق مع تحريك لطيف ، يجب الآن تخزين الأنسجة في الجلسرين لمدة أربعة أشهر على الأقل.

لتعقيم السقالة بالكامل ، ابدأ في تحضير نموذج الغشاء المخاطي للمريء عن طريق ترطيب قطع من سقالة الخنازير التي تم تعقيمها في الجلسرين لمدة أربعة أشهر على الأقل. في 100 مل من PBS المعقمة لمدة خمسة ، 10 تقلبات دقيقة. استبدال supinate ب PBS جديد لكل غسلة.

بعد التحريض الخامس اختبار العقم السقالة مع حضانة ليلية في 100 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، انقل السقالات إلى آبار فردية من ستة ألواح تحت المخاطية لأعلى. ثم ضع حلقة معقمة من الفولاذ المقاوم للصدأ على الدرجة الطبية على وسط كل سقالة واستخدم ملقطا معقما للضغط برفق على الحلقات لضمان ختم مناسب مع الأنسجة خمس مرات.

قم بتوسيط الخلايا الليفية المريئية البشرية الخمسة في 0.2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة في وسط كل حلقة. ثم قم بإغراق المنطقة المحيطة بالجزء الخارجي من الحلقة بما لا يقل عن ملليلترين إضافيين من الخلايا الليفية المتوسطة واحتضان السقالات في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الحلقات واستبدل الوسط الموجود في كل بئر بما لا يقل عن خمسة ملليلتر من الخلايا الليفية الطازجة.

متوسطة ، مع الحرص على أن تكون السقالات مغمورة تماما. بعد أسبوع واحد ، تخلص من الوسط واستخدم الملقط لقلب سطح الغشاء المخاطي للسقالات لأعلى. ضع الحلقات مرة أخرى على السقالات ، ثم أضف مركزا واحدا للخلايا الظهارية الست في 0.2 مل من الوسط المركب ، واحد في وسط كل حلقة.

قم بتوصيل المنطقة خارج الحلقة بحوالي ملليلترين من الوسط المركب وأعد التركيبات إلى الحاضنة. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الحلقات واستبدل الوسط الموجود في كل بئر بما لا يقل عن خمسة ملليلتر من الوسط المركب الطازج ، واحد ، مع التأكد من غمر السقالات بالكامل. بعد 24 ساعة أخرى ، استبدل الوسط بما لا يقل عن خمسة ملليلتر من الوسط المركب. اثنان.

في اليوم الرابع ، ضع شبكات شبكية من الفولاذ المقاوم للصدأ من الدرجة الطبية المعقمة في آبار لوحة جديدة مكونة من ستة آبار ونقل التركيبات إلى الجانب المخاطي للشبكات لأعلى. أخيرا ، أضف ما يكفي من الوسط المركب ثلاثة للوصول إلى الجانب السفلي من المركب مع ترك السطح معرضا للهواء ، مما يضمن الحفاظ على العينة في واجهة سائل الهواء. أصعب جزء من الإجراء هو إعداد واجهة سائل الهواء.

إذا لم يكن من الواضح ما إذا كانت الشبكة في اتصال سائل بطرف معقم للأنبوب ، حيث يسهل معرفة ما إذا كان الأنبوب مغمورا. بدلا من ذلك ، يمكنك محاولة هز اللوحة برفق لأنه من الأسهل رؤية السائل عند تحركه والتحقق من وجود سائل على الشبكة ولا يغطي عينتك. هذا ، يقدم التقييم المنطقي للظهارة ظهارة حرشفية طبقية ناضجة متعددة الطبقات ، مماثلة ولكنها أرق لتلك التي لوحظت مع المريء البشري الطبيعي حيث تصبح الخلايا مسطحة تدريجيا وفي النهاية نووية أثناء هجرتها نحو السطح.

يوضح التوصيف الكيميائي المناعي للعلامات الرئيسية للانتشار والتمايز أن التشريح الدقيق لظهارة النموذج يشبه ظهارة المريء البشرية الطبيعية. على سبيل المثال ، لوحظ تعبير السيتوكيراتين 14 المماثل في كل من المريء الأصلي والظهارة النموذجية مع تلطيخ يقتصر على الخلايا الموجودة في الطبقة القاعدية. تم تعديل هذا النموذج بنجاح لدمج الخلايا السرطانية عن طريق استبدال الخلايا الظهارية الأولية بخلايا سرطانية مما يدل على مرونة النموذج.

على سبيل المثال ، تنتج خلايا السرطان الحرشفية ظهارة مرئية على الهيكل كمنطقة صفراء محددة بها شقوق كبيرة داخل الظهارة ، مما يعكس على الأرجح وجود جزيئات سيليا مختلة وظيفيا ، بما في ذلك خلايا السرطان الغدي للمريء داخل النموذج ينتج عنه كمية كبيرة من تدهور السقالات المرئية للعين على شكل ترقق للسقالة. بعد أسبوعين من النمو في واجهة سائل الهواء وتأكيده في تحليل h و e على أنه انخفاض واضح في سمك السقالة في المنطقة الواقعة أسفل الخلايا بعد هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى للتعبير الجيني مثل النشاف الشمالي أو الغربي على نفس الأنسجة للإجابة على أسئلة مثل ، كيف تستجيب الظهارة للضغوط البيئية؟ لذلك يوفر هذا موردا قيما حقا للنظر في المزيد من الأسئلة بعمق أكبر بعد تطويره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين المهتمين بحؤول باريت لدراسة تأثير التعرض لمكونات ارتجاع معينة على التعبير الجيني في المريء البشري الطبيعي.