طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل البطانة الجيبية الكبدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الكبد أولا ونقعه بالمثبت. بعد ذلك ، يتم تقطيع الكبد إلى كتل وتجفيفه استعدادا للفحص المجهري الإلكتروني.

ثم يتم طلاء عينات الكبد بالرش وفحصها تحت المجهر الإلكتروني. أخيرا ، يتم تحليل الصور المجهرية الإلكترونية وحساب قطر الفتحة والتردد والنسبة المئوية للمسامي. في النهاية ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني لإظهار التغيرات في البطانة الجيبية للكبد في ظل ظروف مختلفة.

توفر لنا هذه الطريقة نظرة ثاقبة للبنية الفائقة ومورفولوجيا الأوعية الدموية للكبد في بطانتها. يمكن استخدامه أيضا لفحص الكلى والدماغ بنفس الطريقة التي يتم بها تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام وفقا للتشريعات المحلية. تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة رعاية في منطقة الصحة المحلية في سيدني.

الإجراءات المسموح بها موصوفة في وثائق ترخيص المشروع وتتبع الإرشادات التي تضمن رفاهية في جميع الأوقات. هذه جراحة غير قابلة للبقاء على قيد الحياة. بعد تحضير المثبت ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بتسخين المخزن المؤقت للتروية والمثبت عند 35 إلى 37 درجة مئوية.

بمجرد تخدير بحقنة واحدة داخل الصفاق من الكيتامين والزيلازين ، قم بتقييم مستوى التخدير عن طريق سحب الطرف الخلفي وقرص الذيل. بعد ذلك ، باستخدام مقص غير حاد ، قم بعمل شق Y في بطن لفضح الكبد والوريد البابي. ثم اربط خيوطين فضفاضتين جدا حول الوريد البابي ، أحدهما قريب من الكبد والآخر بعيدا عن الكبد.

قم بتقنيد الوريد البابي باستخدام قنية وريدية ذات حجم مناسب. ثم شد الغرز لتأمين القنية. الآن باستخدام خمسة إلى 20 مل من PBS دافئة إلى 37 درجة مئوية ، ابدأ التروية عند ضغط 10 سم من H2O.

تجنب دخول فقاعات الهواء إلى الكبد ، والتي من شأنها أن تنتج القطع الأثرية وضغط الهواء مرتفعا جدا ، مما يؤدي إلى تلف الكبد ، وقطع الوريد البطني والصدر CVA للسماح للمخزن المؤقت بالخروج بحرية من الكبد. هذا يمنع ارتفاع ضغط الظهر وتلف الكبد والخلايا الجيبية والبطانية أو LCCs. بمجرد أن يصبح الكبد خاليا من الدم ، استبدل PBS بالفحص المجهري الإلكتروني أو em ، المثبت والنفخ حتى يصلب الكبد ويصبح شاحبا جدا.

حوالي خمس دقائق. ثم باستخدام المشرط ، قم بتقطيع الكبد إلى كتل من واحد إلى اثنين من المليمتر المكعب. استخدم em fixative للنشر.

ثبت الأنسجة عند أربع درجات مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة. ثم انقل الأنسجة إلى 0.1 مولار الصوديوم كيت عازلة ، وخزنها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا لتركيب العينات لمسح المجهر الإلكتروني أو SEM. بعد تجفيف العينات وفقا لبروتوكول النص ، قم بتسمية قاعدة بذرة SEM المعدنية وقم بتطبيق شريط كربوني على الوجهين على الجزء العلوي من بذرة القصص تحت مجهر تشريح ، وتصور العينات لتحديد السطح بأفضل الجيوب الأنفية ل SEM.

الدانتيل ، سطح مختار يواجه سطح الشريط الكربوني للكعب وألصقه بقوة على كعب الروتين. بعد إجراء طلاء الرش و SEM وفقا لبروتوكول النص ، افتح صورة في الصورة J واستخدم شريط مقياس مضمنا في الصورة لضبط المقياس باستخدام أداة المضلع في تتبع الصورة J حول المنطقة المسطحة بأكملها من LSEC ، بما في ذلك المناطق المحشوة والمثبتة ، واستبعاد أي قطع كبيرة من الحطام الموجودة على سطح الخلية والتي قد تحجب الفتحات. لقياس قطر الفتحة، ضع خطا عبر أطول قطر لكل فتحة عن طريق تحديد أداة الخط.

اضغط على M لقياس الخط وD لرسم الخط بشكل دائم على الصورة. يتم تعريف هذا الخط على أنه قطر الفتحات وسيكون متاحا الآن في مربع النتائج للصورة J.قم بقياس جميع الفجوات التي هي ثقوب أكبر في سيتوبلازم LSEC أكثر من 250 نانومتر ، بالإضافة إلى الفتحات. احسب مساحة الفجوات غير الدائرية عن طريق التتبع حولها واستخدام الصورة J لحساب مساحتها بعد البيانات من مربع النتائج في الصورة J في جدول بيانات Excel.

لمزيد من التحليل ، استخدم الصيغ التالية لإجراء حسابات الفتحة. متوسط قطر الفتحات يساوي متوسط جميع أقطار الفتحة. مساحة الفتحات تساوي pi r مربع حيث يتم حساب R من أقطار الفتحات الفردية.

النسبة المئوية للمسامية تساوي sigma pi R تربيع على المساحة الإجمالية التي تم تحليلها والميكرون في 100 تستبعد مجموع مساحة الفجوات من هذا الحساب. لتقديم البيانات في المنشورات ، قم بتضمين قطر الفتحات مع بيان يؤكد أن أقطار الحدود قد استخدمت لتحديد الفتحات ، وتردد الثقب والمسامية ، كما يتضمن بيانا يؤكد ما إذا كانت الفجوات قد تم تضمينها في التحليل ، ورسم بياني لتوزيع التردد لقطر الفتحات وعدد كتل الكبد ، بالإضافة إلى الصور. يكشف التكبير المنخفض بواسطة SEM عن سطح مستو لعينة الكبد مع مساحة مكشوفة كبيرة بما يكفي لمراقبة العديد من أوعية الكبد الكبيرة والجيوب الأنفية ، بما في ذلك المسالك البابية ، و ES المركزي كما هو موضح هنا.

ضمان وضع كتلة الكبد بشكل صحيح على كعب التثبيت أمرا ضروريا للحصول على صور واضحة للجيوب الأنفية والكبسولة اللامعة ، والتي تغطي جميع تفاصيل الجيوب الأنفية للكبد. لهذا السبب ، كما هو موضح هنا ، يسمح التكبير العالي بمراقبة فتحات LSEC. يمكن أن تظهر صفائح خلايا الكبد مثل الأوعية الدموية ، لكن ميزات مثل BLI تساعد في التوجيه.

يوضح هذا الشكل أن ضغط الوفرة العالي يمكن أن يتسبب في حدوث قطع أثرية مثل الفجوات الكبيرة في البطانة التي يعتقد أنها ناتجة عن اندماج ألواح LSEC SIV التي يمكن التعرف عليها بسهولة تحت SEM ، وتجنب غشاء الخلية مباشرة فوق النوى ، والتي يمكن رؤيتها على أنها انتفاخ تحت سطح LSEC سيساعد في دقة كثافة الفتحات وحسابات المسامية. أخيرا ، يوفر القياس الكمي لكثافة وتكرار قطر فتحات LSEC قياسا تجريبيا للفتحات ويسمح بقياسات التغييرات الناجمة عن الشيخوخة أو الأمراض أو السموم أو العلاجات. بعد إجراء التروية ، يمكن معالجة الأنسجة لتقنيات أخرى مثل المجهر الإلكتروني للإرسال للنظر في البنية الفائقة الخلوية وبنية الميتوكوندريا.

يمكن استخدامه أيضا في علم الأنسجة.