طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل البطانة الجيبية للكبد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الكبد وترويضه بالمثبت. بعد ذلك، يتم تقطيع الكبد إلى كتل وتجفيفها استعداداً للفحص بالمجهر الإلكتروني.

بعد ذلك، يتم طلاء عينات الكبد بالترذيذ وفحصها تحت المجهر الإلكتروني. وأخيراً، يتم تحليل الصور المجهرية الإلكترونية وحساب قطر وتكرار النوافذ ونسبة المسامية. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الإلكتروني لإظهار التغيرات في بطانة الجيوب الكبدية تحت ظروف مختلفة.

توفر لنا هذه الطريقة نظرة متعمقة في البنية الدقيقة ومورفولوجيا الأوعية الدموية الكبدية في بطانتها الغشائية. كما يمكن استخدامها لفحص الكلى والدماغ بنفس الطريقة. تُنفذ جميع الإجراءات التي تتضمن استخدام الحيوانات وفقًا للتشريعات المحلية. وقد تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة رعاية الحيوان في منطقة سيدني الصحية المحلية.

توضح وثائق ترخيص المشروع الإجراءات المسموح بها، وتتبع الإرشادات التي تضمن سلامة الحيوان في جميع الأوقات. هذه الجراحة غير بقائية. بعد تحضير المثبت، وفقاً للبروتوكول النصي، قم بتدفئة محلول التروية والمثبت عند درجة حرارة 35 إلى 37 درجة Celsius.

بمجرد تخدير الحيوان عن طريق حقنة واحدة داخل الصفاق من الكيتامين والزيلازين، يتم تقييم مستوى التسكين من خلال سحب الطرف الخلفي وقرص الذيل. بعد ذلك، وباستخدام مقص ذو طرف غير حاد، يتم إجراء شق على شكل حرف Y في بطن الحيوان لكشف الكبد والوريد البابي. ثم يتم ربط غرزتين رخوتين جداً حول الوريد البابي، إحداهما في الجهة القريبة من الكبد والأخرى في الجهة الأكثر بُعداً عن الكبد.

قم بتركيب كانيولا وريدية ذات حجم مناسب في الوريد البابي. بعد ذلك، أحكم ربط الغرز لتثبيت الكانيولا. الآن، باستخدام 5 إلى 20 ملليلتر من PBS مدفأ إلى 37 درجة Celsius، ابدأ عملية التروية عند ضغط قدره 10 سنتيمتر من H2O.

تجنب دخول فقاعات الهواء إلى الكبد، لأن ذلك قد يؤدي إلى ظهور تشوهات اصطناعية وزيادة مفرطة في ضغط الهواء، مما يسبب تلف الكبد؛ قم بقطع الوريد الأجوف البطني والصدري (Vena CVA) للسماح للمحلول المنظم بالخروج بحرية من الكبد. يمنع هذا الإجراء حدوث ضغط عكسي مرتفع، ويحمي الكبد والخلايا الجيبية والخلايا البطانية أو الخلايا الكبدية (LCCs) من التلف. وبمجرد خلو الكبد من الدم، استبدل محلول PBS بمثبت المجهر الإلكتروني (em) وقم بإجراء التروية حتى يتصلب الكبد ويصبح شاحب اللون للغاية.

حوالي خمس دقائق. ثم باستخدام المشرط، يتم تقطيع الكبد إلى مكعبات يتراوح حجمها من 1 إلى 2 مليمتر مكعب. استخدم المثبت للتثبيت البعدي.

قم بتثبيت النسيج عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح من 24 إلى 72 ساعة. بعد ذلك، انقل النسيج إلى محلول منظم من sodium Cate بتركيز 0.1 molar، واحفظه عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 12 شهرًا لتجهيز العينات للفحص بالمجهر الإلكتروني الماسح (SEM). بعد تجفيف العينات وفقًا للبروتوكول النصي، قم بوضع علامة على قاعدة حوامل SEM المعدنية وثبّت شريط كربون مزدوج الجوانب على الجزء العلوي من الحوامل باستخدام مجهر تشريحي، ثم افحص العينات لتحديد السطح الذي يحتوي على أفضل الجيوب الوريدية للفحص بواسطة SEM.

ضع الدانتيل بحيث يكون السطح المختار مواجهاً للأعلى على سطح الشريط الكربوني الموجود على القاعدة، وثبته بإحكام على القاعدة. بعد إجراء عملية الطلاء بالترذيذ والتصوير بالمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وفقاً للبروتوكول المذكور، افتح الصورة في برنامج image J واستخدم شريط المقياس المدمج في الصورة لضبط المقياس باستخدام أداة المضلع (polygon tool) في برنامج image J، ثم ارسم حدود المنطقة المسطحة الكاملة من خلية LSEC، بما في ذلك المناطق المنفذة وغير المنفذة، مع استبعاد أي قطع كبيرة من الحطام الموجودة على سطح الخلية والتي قد تحجب الثقوب. لقياس قطر الثقوب، ارسم خطاً عبر القطر الأطول لكل ثقب عن طريق اختيار أداة الخط (line tool).

اضغط على M لقياس الخط و D لرسم الخط بشكل دائم على الصورة. يتم تعريف هذا الخط على أنه قطر النافذة (fenestration diameter) وسيكون متاحاً الآن في مربع النتائج في برنامج Image J. قم بقياس جميع الفجوات التي تمثل ثقوباً أكبر في سيتوبلازم LSEC يتجاوز قطرها 250 nanometers، بالإضافة إلى النوافذ. احسب مساحة الفجوات غير الدائرية من خلال تتبع محيطها واستخدام برنامج Image J لحساب مساحتها، ثم انقل البيانات من مربع النتائج في برنامج Image J إلى جدول بيانات Excel.

لإجراء مزيد من التحليل، استخدم الصيغ التالية لإجراء حسابات التثقيب. يساوي متوسط قطر التثقيب متوسط جميع أقطار التثقيب. وتساوي مساحة التثقيب pi r squared حيث يتم حساب R من أقطار التثقيب الفردية.

تساوي نسبة المسامية sigma pi R squared مقسومة على إجمالي المساحة التي تم تحليلها مضروبة في ميكرون × 100 مع استبعاد مجموع مساحة الفجوات من هذه الحسبة. ولعرض البيانات في المنشورات، يجب إدراج قطر الفتحات مع بيان يؤكد استخدام أقطار الحدود لتعريف الفتحات، وتكرار الفتحات، والمسامية؛ كما يجب إدراج بيان يؤكد ما إذا كانت الفجوات قد أُدرجت في التحليل أم لا، ورسم بياني للتوزيع التكراري لقطر الفتحات وعدد كتل الكبد بالإضافة إلى الصور. ويكشف التكبير المنخفض باستخدام SEM عن سطح مستوٍ لعينة الكبد مع مساحة مكشوفة كبيرة بما يكفي لملاحظة العديد من أوعية الكبد الكبيرة والجيوب الأنفية، بما في ذلك المسلك البابي، و ES المركزية كما هو موضح هنا.

يعد ضمان وضع كتلة الكبد بشكل صحيح على قاعدة التثبيت أمراً ضرورياً للحصول على صور واضحة للجيبانيات، ويجب تجنب كبسولة Glissons التي تغطي كافة تفاصيل جيبانيات الكبد. لهذا السبب، وكما هو موضح هنا، تتيح قوة التكبير الأعلى ملاحظة ثقوب الخلايا البطانية الجيبانية الكبدية (LSEC). قد تظهر صفائح الخلايا الكبدية مثل الأوعية الدموية، ولكن هناك سمات مثل BLI تساعد في تحديد الاتجاه.

توضح هذه الصورة أن ضغط التروية العالي يمكن أن يتسبب في ظهور شوائب اصطناعية، مثل الفجوات الكبيرة في البطانة التي يُعتقد أنها ناتجة عن اندماج صفائح SIV في خلايا LSEC، والتي يمكن تحديدها بسهولة تحت المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). إن تجنب غشاء الخلية الموجود مباشرة فوق النوى، والذي يمكن رؤيته كبروز تحت سطح خلايا LSEC، سيساعد في دقة حسابات كثافة النوافذ والمسامية. وأخيرًا، يوفر التحديد الكمي لقطر ونوافذ وكثافة وتكرار نوافذ LSEC قياسًا تجريبيًا لهذه النوافذ ويسمح بقياس التغيرات الناجمة عن الشيخوخة أو المرض أو السموم أو العلاجات. وبعد إجراء عملية التروية، يمكن معالجة النسيج لتقنيات أخرى مثل المجهر الإلكتروني النافذ لفحص البنية الدقيقة للخلايا وبنية الميتوكوندريا.

يمكن استخدامه أيضاً في علم الأنسجة.