عزل خلايا وحيدات النوى من الجهاز العصبي المركزي مع الجرذان EAE

حسناً. مرحباً، أنا كريستين بيتون، باحثة مساعدة في مختبر جورج تشن في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا إيرفاين. وسأوضح لكم اليوم كيفية عزل الخلايا وحيدة النواة من الجهاز العصبي المركزي للجرذان.

تتضمن هذه العملية تخدير الجرذ تخديرًا عميقًا لإجراء تروية قلبية، وذلك لضمان عدم وجود أي دم ملوث في الجهاز العص신 المركزي. عند استخراج العضو، سنقوم بإزالة الدماغ والنخاع الشوكي لتحضير معلق من الخلايا المفردة باستخدام مصفاة الخلايا، ومن ثم سنقوم بعزل الخلايا وحيدة النواة باستخدام تدرج مزدوج الطبقة من مادة percoll. لنبدأ الآن.

أنا الآن مستعدة لإجراء التروية القلبية، لذا سأعرض جميع المواد التي أحتاجها لذلك. أول شيء نحتاجه هو وعاء بل (Bell jar)، وقد وضعنا هنا في الأسفل مناشف ورقية مشبعة بمخدر متطاير. يمكنك استخدام halothane أو isoflurane.

الشيء التالي الذي نحتاجه هو أداة لتثبيت الجرذ وأداة أخرى لجمع الدم. لذا، لدينا هذا التجهيز المؤقت لإجراء عملية التروية للجرذان. ستستخدم إبرة قياس 21 gauge، وسنقوم بتروية محلول ملحي يتم تغذيته بالجاذبية عبر نظام تروية وريدي IV.

إذا لم يكن لديك إمكانية الوصول إلى أحد هذه الأنظمة، يمكنك أيضاً ملء عدة محاقن بالمحلول الملحي وإجراء التروية يدوياً. ولكن هذه الطريقة أسهل بكثير. وما نحتاجه أيضاً هو أسطوانة محقنة سعة 10 mil وضعنا فيها مناديل Kim wipes.

وسأقوم بوضع بعض من المخدر فيه لوضعه على أنف الجرذ لضمان بقائه تحت تأثير التخدير العميق أثناء الإجراء. وبالطبع، ستحتاج إلى أدوات؛ لذا لن أقوم اليوم بإجراء تعقيمي لأنني لن أضع الخلايا في المزرعة.

إن جميع الأدوات التي أستخدمها ليست معقمة. ولكن بالطبع، إذا كنت ترغب في وضع خلاياك في مزرعة خلوية، فقد تود استخدام أدوات معقمة. ولأغراض هذا الفيديو، سأستخدم جرذًا نافقًا بالفعل.

لذا، سأقوم بتنفيذ الإجراء ببطء لأعرضه لكم خطوة بخطوة. وبالطبع، في الإجراء الفعلي، ستحتاجون إلى جرذ تحت تأثير تخدير عميق، ولكن ليس ميتاً؛ إذ يجب أن يظل القلب ينبض.

لنبدأ الآن مع هذا الجرذ. لقد وضعت الجرذ على ظهره بحيث يكون وجهه بعيدًا عني، ووضعت مناديل مبللة بمادة التريكلورو إيثيلين فوق أنفه. وأول شيء سأقوم به هو التحقق من أن الجرذ في حالة تخدير عميقة.

لذا يجب عليك القيام بذلك قبل كل إجراء من هذه الإجراءات. لذا، آخذ الملقط وأقرص الجرذ، ولا يكون هناك أي رد فعل على الإطلاق. إذا حدث أي رد فعل، فيجب عليك إعادة الجرذ إلى جهاز التخدير للتأكد من تخديره بعمق.

بعد ذلك، سأستخدم ethanol بتركيز 70% لنقع النصف العلوي من الجرذ. ثم سأقوم بفتح التجويف الصدري؛ لذا سأبدأ أولاً بقطع الجلد وفتحه من الجانب.

بعد ذلك سأقوم بفتح التجويف نفسه. هذه الكتلة هنا هي القلب. وهنا يمكنك رؤية الأذين الأيمن.

هذا هو الجزء الذي سأقوم بقصه للسماح للدم بالتدفق إلى الخارج. ومن ثم، لتروية الجسم بالكامل، أحتاج إلى إدخال الإبرة في البطين الأيسر. لذا سأقوم بإدخال الإبرة هنا تماماً.

وبمجرد إدخال الإبرة، سأقوم بفتح أنبوب الوريد للسماح بتدفق المحلول الملحي، وسأتركه لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. إذا كان التروية جيدة، ستلاحظ تغير لون النبض الأحمر والأنف الأحمر وعيون الجرذ بالطبع، مما يشير إلى خروج الدم من جسم الجرذ. وهذا يعني أن عملية التروية يجب أن تكون جيدة.

إليك الجرذ بعد التروية القلبية. وكما تلاحظ، فإن أنف هذا الجرذ وأذنيه وعينيه لم تعد وردية أو حمراء، بل أصبحت بيضاء تماماً، مما يشير إلى أن التروية تمت بنجاح.

لقد غادر معظم الدم أو كلّه بقع الجرذ. والآن، بعد أن تم إجراء التروية القلبية للجرذ، أحتاج إلى قطع رأسه؛ أي يجب عليّ فصل رأس الجرذ.

وسأستخدم من أجل ذلك أدوات المختبر العادية. والآن سأقوم بإزالة الدماغ من الجرذ؛ لذا سأقوم بغمر كل الفراء بـ 70% ethanol فقط لتجنب تطاير الفراء في كل مكان.

بعد ذلك، سأقوم بإزالة الجلد أولاً. وبما أنني لن أستخدم الدماغ في الفحص النسيجي، وسأقوم بتقطيعه إلى قطع صغيرة، فلن أكون حذرًا للغاية في إخراجه بشكل نظيف. كقطعة واحدة، سأقوم بإدخال المقص عند قاعدة الجمجمة حيث يتصل الدماغ بالنخاع الشوكي هنا تمامًا.

وسأقوم بقص العظم من كل جانب، ثم سأزيل الجزء العلوي. وسأكرر هذه العملية مراراً وتكراراً. وهكذا أصبح الدماغ مكشوفاً بالكامل.

وكما تلاحظون، فقد تمت عملية التروية بنجاح لأن الدماغ يبدو صافياً تماماً. ففي الحيوان غير المروي، ستجدون أن الطبقة العلوية من الدماغ مغطاة بالكامل بالشعيرات الدموية الحمراء، ولكن بما أنكم لا ترونها على الإطلاق، فهذا يعني أن التروية قد تمت بشكل جيد. والآن سأقوم بإخراج الدماغ، مع الحرص على عدم ترك البصلة الشمية، وسأضعه في أنبوب يحتوي على PBS مبرد على الثلج.

والآن، دون القلق الشديد بشأن الحفاظ عليه سليماً، سأضع الدماغ في أنبوب يحتوي على PBS، وسأقوم بقطع الأعصاب البصرية، ثم باستخدام ملعقة مسطحة (spatula)، سيخرج الدماغ بسهولة تامة. والآن سأقوم بإزالة الحبل الشوكي من ذات الجرذ. وهنا أيضاً، بما أننا سنقوم بتقطيعه إلى قطع صغيرة، لن أكون حريصاً جداً على إخراجه بدقة فائقة، طالما أنني استخرجت الحبل الشوكي بالكامل.

قمت أولاً بقص الجلد على طول العمود الفقري، والعمود الفقري ظاهر هنا. بعد ذلك، سأقوم بإزالة اللحم من هنا بحيث ينكشف العمود الفقري على طوله. ويمكنكم رؤية النخاع الشوكي هنا تماماً.

لذا في الفأر، يمكنك قطع كلا الطرفين وحقن PBS باستخدام المحقنة، وسيخرج النخاع الشوكي كقطعة واحدة تقريباً. ولكن في الجرذان، الأمر ليس بهذه السهولة؛ حيث يتعين عليّ فتحه واستخراج النخاع الشوكي يدوياً.

أقوم الآن بالقص على كلا الجانبين، وكما فعلت مع الدماغ، أقوم بالقص وإزالة العظم بحيث أكشف الحبل الشوكي. وكما هو الحال بالنسبة للدماغ، فإن الحبل الشوكي أبيض تماماً، مما يدل على أن التروية القلبية قد تمت بنجاح. وسأقوم بذلك على طول العمود الفقري بالكامل.

أهبط إلى مستوى الوركين الأيمنين، وهو هنا تماماً. ثم سأستخدم الملقط، ورغم أن هذه العملية ليست دقيقة للغاية، إلا أنني سأقوم بسحب الحبل الشوكي ووضعه في الأنبوب مع الدماغ. الآن، لدي في الأنبوب كل من الدماغ والحبل الشوكي للجرذ، وأنا مستعد الآن لتحضير معلق الخلايا المفردة.

أنا الآن مستعدة لتحضير معلق خلوي أحادي من جهازي العصبي المركزي. وللقيام بذلك، سأحتاج إلى طبق بتري بحجم 10 سنتيمتر، سأضع بداخله مصفاة خلايا بمسامية 70 ميكرون. سأستخدم أيضاً مكبس سرنجة سعة 1 مل، كما أحتاج إلى ملاقط ومقص.

سأقوم بوضع عينتي في مصفاة الخلايا والتأكد من عدم بقاء أي شيء في الأنبوب. بعد ذلك، سأقوم بتقطيعها إلى قطع صغيرة، مع خلط الدماغ والنخاع الشوكي معاً. وبمجرد فرم كل شيء تماماً، سأستخدم مكبس حقنة oneill للضغط عليها ودفعها من خلال المصفاة.

وستلاحظ تدريجياً أن محلول PBS خارج مصفاة الخلايا سيصبح أكثر عكارة مع مرور الخلايا المفردة. وبالطبع، إذا كنت أرغب في تعقيم معلق الخلايا، سأقوم بذلك داخل غطاء زراعة الأنسجة ولن أضع أصابعي فيه. والآن، بما أن محلول PBS أصبح عكراً، سأقوم بجمعه للمرة الأولى ووضعه في أنبوب سعة 50 mil.

لكنني سأستمر في المراقبة، وسأقوم بإضافة المزيد من PBS إلى مصفاة الخلايا، ثم سأقوم بالضغط عليها. وبما أن الجهاز العصبي المركزي (CNS) يحتوي على كمية كبيرة من الدهون، فإنه يعد أحد أكثر الأعضاء التي أجد صعوبة في تحضير معلق خلوي منها باستخدام هذه التقنية. لذا، فقد قمت بضغط كل أنسجة الجهاز العصبي المركزي عبر مصفاة الخلايا عدة مرات، وجمعت كل معلق الخلايا المفردة.

وهنا الأنبوب الذي ملأته حتى 50 mL باستخدام PBS يحتوي على معلق الخلايا المفردة المُعد من الجهاز العصبي المركزي (CNS) للجانب الأيمن. والآن، سأقوم بطرد هذا الأنبوب مركزياً لتجهيزه للتدرج، وقد انتهت عملية الطرد الآن. لدينا راسب حالياً، لذا سأقوم بالتخلص من السائل العلوي وسأعيد تعليق خلاياي في 20 mL من Percoll بنسبة 30% في PBS.

سأقوم بإضافة ذلك فوق 10 mL من 70% Percoll في PBS لإجراء عملية الفصل بالهجرة. لذا سأتخلص من السائل العلوي. ثم أقوم بتفكيك الراسب للتأكد من أن الخلايا في حالة تعليق أحادي وليست متكتلة في الراسب.

لقد حصلت الآن على معلق من خلايا الجهاز العصبي المركزي في شكل معلق خلوي مفرد. سأقوم بتعليق هذه الخلايا في 20 mls من Percoll بنسبة 30% في PBS، ثم سأضع هذه الـ 20 mls فوق 10 mls من Percoll بنسبة 70% في PBS. بعد ذلك، سأقوم بطردها مركزياً.

سأقوم الآن بأخذ 20 mL من معلق الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وسأضعه ببطء فوق طبقة Percoll بتركيز 70% لتسهيل العملية. يمكنك أيضاً إضافة صبغة مثل الأحمر الفينولي (phenol red) في إحدى الطبقات، ولكنني لست متأكداً تماماً مما تفعله بالخلايا إن كانت تؤثر عليها، لذا أحاول تجنب استخدامها.

يجب أن تتم العملية ببطء كافٍ لضمان عدم اختلاط الطبقتين، لذا يجب تجنب حدوث أي اضطراب كبير في الطبقة السفلية. ومعما تزداد سماكة الطبقة العلوية، يمكن زيادة السرعة. والآن، قمت بإضافة الخلايا إلى التدرج.

إذًا، الطبقة الشفافة الموجودة في الأسفل هي طبقة perkel بتركيز 70%، والطبقة العكرة في الأعلى هي طبقة perkel بتركيز 30% والتي تحتوي على معلق الخلايا المفردة الخاص بي. سأقوم الآن بوضع هذا الأنبوب في جهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة، وسأتمكن من رؤية طبقة الخلايا وحيدة النواة إذا تمت العملية بشكل صحيح. الآن، انتهينا من عملية تدوير التدرج.

لذلك، وكما هو معتاد، يتم إجراء عملية الطرد المركزي المتدرج، مع الحرص الشديد على إيقاف تشغيل المكبح حتى لا يتسبب في تخريب التدرج عن طريق التباطؤ بسرعة كبيرة. والآن أصبح لدينا الطبقات؛ حيث توجد طبقة من الدهون فوق التدرج، وسأقوم بإزالتها لتجنب تلوث معلق الخلايا الخاص بي.

وعند الواجهة بين طبقتي البيركيل 30% و70%، تلاحظون أن الواجهة ليست حادة بل ضبابية، وهنا تتواجد الخلايا. وبمجرد قيامي بإزالة الخلايا، ستلاحظون أن الواجهة ستصبح أكثر حدة بكثير. لذا، سأقوم فقط بإزالة الجزء الأكبر من الدهون من الطبقة العلوية ووضعها في النفايات.

ليس من الضروري إزالة كل الكمية، ولكن أريد إزالة قدر كافٍ بحيث لا تغطي المادة الماصة بالكامل عند النزول لسحب خلايا المونوكول. والآن، سأستخدم ماصة نقل أخرى للوصول إلى مستوى السطح الفاصل وسأقوم بجمع الخلايا. وهكذا، قمت الآن بجمع عدة مليلترات من السطح الفاصل.

لذا، فمن المحتمل أنني حصلت على جميع الخلايا التي يمكنني استخلاصها من هناك. لقد كان عدد الخلايا أحادية النواة في ذلك الجهاز العصبي المركزي صغيراً جداً. والآن، أصبحت الخلايا أحادية النواة موجودة في الأنبوب.

سأقوم بملء هذا الأنبوب حتى 50 mL باستخدام PBS، ثم سأقوم بطرد الخلايا مركزياً لترسيبها، مما سيؤدي إلى غسل perle. وأوصي بغسلها مرتين على الأقل باستخدام أنبوب كامل من PBS للتأكد من التخلص من جميع الـ perle. وبعد ذلك، تصبح الخلايا جاهزة لأي إجراء ترغب في القيام به بها.

لقد أوضحت لكم اليوم كيفية عزل الخلايا وحيدة النواة من الجهاز العصبي المركزي للجرذان. وبالطبع، بمجرد الحصول على هذه الخلايا وحيدة النواة، يمكنكم تنقيتها بشكل أكبر لعزل الخلايا اللمفاوية T، على سبيل المثال، من هذه المجموعة. وما سأقوم به باستخدام هذه الخلايا هو إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي للكشف عن المجموعات الخلوية التي كانت موجودة في الدماغ.

مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في عملية عزل الخلايا.