سطح تعزيز رامان الطيفي كشف الجزيئات الحيوية عن طريق EBL مصنعة ذات البنية النانومترية ركائز
مارس 20, 2015
نصف تصنيع وتوصيف الأنظمة البيولوجية النانوية التي تتفاعل بين ركائز البنية النانوية والبروتينات المجمدة والأبتامر. تم الإبلاغ عن الخطوات التجريبية ذات الصلة التي تتضمن التصنيع الصخري للركائز ذات البنية النانوية ، والوظيفة الحيوية ، وتوصيف التحليل الطيفي رامان المعزز بالسطح (SERS). تم إثبات اكتشاف SERS للبروتينات المثبتة على السطح ، وفحص ارتباط البروتين والرابطة الأبتامر-ليجند.
الهدف العام من التجربة التالية هو تصنيع وتوصيف الأنظمة البيولوجية النانوية المترافقة التي تتفاعل بين ركائز نانو صلبة هيكلية مع جزيئات حيوية ثابتة. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون عالي الدقة أو EBL للحصول على مصفوفات من الهياكل النانوية المعدنية الصغيرة على دعامات السيليكا المنصهرة. كخطوة ثانية ، يتم وضع الركائز في محلول ويتم تثبيت الجزيئات الحيوية على أسطحها ، مما ينتج عنه واجهات بيولوجية نانوية.
يتم استخدام التحليل الطيفي للرامين المعزز للسطح التالي أو SIRS من أجل استكشاف الجزيئات البيولوجية في الواجهات. تظهر أطياف السير الناتجة خاصية وضع الرامين لجزيئات معينة ذات كثافة تعتمد بشدة على تصميم الركيزة. الميزة الرئيسية لنهجنا على التقنيات الحالية مثل التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء هي أنه يمكن تعزيز الحساسية بشكل كبير بسبب البلازما السطحية والرنين داخل الهياكل النانوية المعدنية.
يخلق نهجنا أسطحا انتقائية للغاية يمكن التحكم فيها بسهولة باستخدام مزيج من الوظيفة الجزيئية والطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية عبر مجالات متعددة من أبحاث الاستكشاف في البيولوجيا الهيكلية أو الخدمة التي تعبئتها البوليمرات إلى تطوير أجهزة مختلفة تتضمن واجهات بيولوجية نانوية. يمكن أن توفر هذه الأساليب في العلم الخصائص الهيكلية للجزيئات الحيوية مع الآثار المترتبة على التشخيص الطبي أو الكشف البيئي.
بشكل عام ، يمكن للأفراد الجدد في هذه الطريقة أن يكافحوا لأنها تنطوي على جوانب من تصنيع النانو ، ووظائف السطح ، والكيمياء الحيوية ، والتحليل الطيفي ، والتي لم تكن مرتبطة تقليديا لبدء تدور طبقة بولي ميثيل ميثاكريلات أو PMMA ، مقاومة وطبقات موصلة على الركائز. لتحقيق ذلك ، استخدم دوار الرقاقة مع ظرف فراغ وضع العينات بشكل فردي في المنتصف على الظرف. ضع قطرة واحدة من مقاومة PMMA في وسط العينات باستخدام ماصة زجاجية.
ثم تدور بسرعة 3 ، 500 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية مع وقت تسارع لمدة ثانيتين. بعد ذلك ، اخبز الركائز على حرارة 180 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق بعد خبز الركائز ، وقم بتبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة مع تبريد الركائز والعودة إلى ظرف الدوار. انشر قطرة من البوليمر الموصل على الركيزة.
قم بتدوير الركيزة لمدة 40 ثانية بسرعة 3000 دورة في الدقيقة مع منحدر ثانيتين بعد الدوران. اخبز العينات على حرارة 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة بعد إجراء الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون أو التعرض ل EBL كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإعداد دورق بالماء المتأين لإزالة البوليمر الموصل. ثم حضري كوبا ثانيا بخليط المطور وقلبي لمدة خمس دقائق ، واضبطي درجة حرارة الغرفة.
أخيرا ، قم بإعداد الأيزوبروبانول في دورق ثالث كعامل شطف باستخدام الملقط. ضع العينات في الماء لمدة ثلاث ثوان لإزالة فيلم البوليمر الموصل. ثم ضع العينة في المطور وحرك الملقط ببطء لأعلى ولأسفل لمدة 20 ثانية ، وانقل الركائز على الفور إلى الأيزوبروبانول واشطفها لمدة 10 ثوان أخرى قبل تجفيف العينة بالنيتروجين ، وقم بتحميل العينات رأسا على عقب في نظام مبخر شعاع الإلكترون للسماح بترسيب المعدن المتبخر على الوجه الأمامي للعينات.
قم بإيداع طبقة ذهبية بسمك 10 نانومتر على عينات التصميمات الأولى والثالثة وطبقة فضية بسمك 10 نانومتر للتصميم. اثنان بمعدل 0.1 نانومتر تقريبا في الثانية. ثم املأ نظام صوتنة إلى الارتفاع الموصى به بالماء واملأ دورق منفصلا بالأسيتون.
ضع عينة ووجهها لأعلى في قاع الدورق واترك العينة تنقع لمدة 10 دقائق مع إمساك الدورق بها. ضعه في الحمام المائي واترك ارتفاع الأسيتون يتطابق مع ارتفاع الماء. ثم قم بتشغيل نظام الصوتنة.
السماح بالصوتنة لحدوث لمدة تصل إلى 60 ثانية. لإعداد عينة واحدة من تصميم أولا ، قم بإعداد محلول مليمول واحد من MUA والإيثانول في درجة حرارة الغرفة والصوتنة لمدة 10 دقائق. اغمر الركيزة ذات الهيكل النانوي المناسب في محلول MUA لمدة 48 ساعة.
ثم شطف العينة بالإيثانول ثلاث مرات وجفف لمدة خمس دقائق. اضبط درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول 75 ملليمولار من EDC والماء المقطر.
قم أيضا بإعداد محلول 15 ملليمولار من NHS في الماء المقطر باستخدام رواسب ماصة صغيرة ، و 100 ميكرولتر من NHS على الذهب على الركيزة ، وأضف على الفور 100 ميكرولتر من EDC في نفس المنطقة. احتضن لمدة دقيقة واحدة لتنشيط الطبقة الأحادية ذاتية التجميع ل MUA. ثم ضع قطرة 100 ميكرولتر من البروتين ، وهو محلول في نفس المنطقة من الركيزة.
ضع العينة في حجرة واحدة من طبق بتري مع ملليلتر واحد من الماء المقطر في حجرة أخرى. أغلق طبق بتري بغطاء وقم بتخزين العينة لمدة 24 ساعة عند خمس درجات مئوية. بعد ذلك ، اشطف العينة بالماء المقطر ثلاث مرات عن طريق العينات باستمرار في أكواب منفصلة لمدة 20 ثانية في كل دورق ، ولا تدع العينات تجف بعد الشطف أو أثناء الشطف لتصميم عينتين.
قم بإعداد محلول 0.9 ملليمولار من بروتين ربط الجلوكوز أو GBP في مخزن فوسفات البوتاسيوم. قم أيضا بإعداد محلول 100 مللي مولار من جلوكوز DG في المخزن المؤقت. بعد ذلك ، امزج 30 ميكرولترا من محلول الجلوكوز D و 30 ميكرولترا من محلول GBP.
باستخدام حاوية أنبوب بلاستيكي دقيق سعة مليلتر واحد وماصة صغيرة ، احتضن لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بإيداع 20 ميكرولترا من محلول GBP الخالي من الترابط و 20 ميكرولترا من محلول GBP المرتبط بالترابط على الركائز المعدة. باستخدام ماصة دقيقة ، قم بتخزين العينات على درجة حرارة خمس درجات مئوية لمدة 24 ساعة في طبق بتري بغطاء مغلق. شطف العينات ثلاث مرات في محلول عازلة فوسفات البوتاسيوم في درجة حرارة الغرفة للتحضير.
تصميم ثلاث عينات تخفف من بعد ربط الدوبامين أو محلول DBA إلى تركيز ميكرومولار واحد. باستخدام المخزن المؤقت tris EDTA بدرجة حموضة نهائية تبلغ 7.4 ، قم بإعداد محلول الدوبامين بتركيز خمسة ميكرومولار عن طريق قياس مسحوق الدوبامين على ميزان تحليلي وخلطه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS مع حبة تحريك لمدة خمس دقائق. ثم قم بإيداع قطرة 20 ميكرولتر من محلول DBA على سطح كل ركيزة ، واترك العينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع غطاء فوق طبق بتري.
بعد شطف العينات ثلاث مرات في مخزن مؤقت لفوسفات البوتاسيوم ، ضع العينات في وضع مستقيم فوق مسح نظيف من درجة الغرفة لتجفيف الجانب الخلفي مع الحفاظ على فيلم على الجانب الأمامي من الركيزة. ضع عينة جانبا كعنصر تحكم. بعد ذلك ، ضع قطرة من خمسة ميكرولتر من محلول الدوبامين على سطح PBS الحالي.
إسقاط على العينات المتبقية. احتضان العينات لمدة 10 دقائق قبل شطف العينات في محلول عازلة فوسفات البوتاسيوم ثلاث مرات. لإجراء التحليل الطيفي للرامين.
ضع كل عينة في غرفة مقاومة للماء لتجنب التبخر عن طريق التعرض لليزر. املأ حقنة بلاستيكية بشحم عالي الفراغ خامل كيميائيا. ثم ضع العينات على شرائح زجاجية وقم بتوزيع بضعة ملليمترات من الشحوم المحيطة بالعينات دون لمس العينات.
ضع زلة غطاء المجهر أعلى الركائز. اضغط برفق لأسفل لتشكيل مانع للتسرب ، مما يؤدي إلى إنشاء واجهة سائلة رفيعة بين الركائز والغطاء ينزلق دون السماح للمخزن المؤقت بالتلامس مع الشحوم المفرغة. باستخدام نظام مجهر رامان البصري ، احصل على تركيز على سطح منطقة نمط النانو المعدني المراد أخذ عينات منها دون تشغيل الليزر.
قم بإجراء أخذ عينات رامان كما هو موضح في بروتوكول النص الموضح. فيما يلي مصفوفات النقاط ذات النمط النانوي من الذهب والنيكل الفضي على السيليكا المنصهرة. يسمح استخدام الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون أو EBL بوضع وأبعاد رائعين.
يتم التحكم في حجم نقطة التحكم وعرض الفجوة عن طريق التعرض ل EBL. يتم عرض مصفوفات الجرعة السداسية من نهاية الذهب من النيكل الفضي هنا. ينتج عن سلوك التنوي لهذه الطبقات المعدنية الرقيقة جدا هياكل متقطعة.
فيما يلي سلسلة الطيف من البروتين الثابت الركيزة A في التصميم شدة إشارة واحدة من المصفوفة الأولى أقوى بكثير من المصفوفة الثانية. كانت الإشارة من المصفوفة الثالثة ضعيفة للغاية. من الواضح أن تباعد الفجوات هو معلمة حاسمة لفصل البلازما وتحسين سطح تشتت الرامين المعروض.
فيما يلي أطياف بروتين ربط الجلوكوز التي توضح تأثيرات تصميمات الركيزة المختلفة في الحالة الحرة للترابط والمرتبطة بالترابط. أخيرا ، تظهر أطياف s من أبتامر ربط الدوبامين للجزيئات الخالية من الترابط والرابطة يظهر طيف من مسحوق الدوبامين كمرجع.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تجنب تلوث الركائز. نظرا لأن تقنية التحليل الطيفي حساسة للغاية ويمكن أن يكون لديك قراءات خاطئة باستخدام هذا الإجراء. يمكن تحديد تصميمات الركيزة المصدر المثلى لتحليلات معينة.
ثم يمكن تنفيذ طرق nphy أخرى مثل phy غير المطبوعة لتحسين قابلية توسع تصنيع الركيزة بعد تطويرها. ساعدت هذه التقنية الباحثين في مجال الكيمياء الحيوية والاستشعار الحيوي على اكتشاف الجزيئات البيولوجية التي لا تحتوي على أسطح معينة بكميات صغيرة جدا مع البقاء في المحلول. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية التحكم في حجم البنية النانوية المعدنية وخصائص الفيلم باستخدام تقنيات التصنيع وكيفية استغلال استراتيجيات التعرف الجزيئي الحيوي المختلفة لاستهداف التحليلات المختلفة.
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة تفاصيل تصنيع وخصائص الأنظمة النانوية الحيوية التي تربط بين الركائز النانوية المنظمة والبروتينات والأبتامرات المثبتة. تشمل الأساليب التصنيع الlithographic، والتفعيل الحيوي، وقياس الطيف الرامانية المعزز بالسطح (SERS).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- النانوبيوتكنولوجي
- التفاعلات الحيوية الجزيئية
- الطيف المعزز بالسطح
الخلفية
- يستخدم lithography الشعاع الإلكتروني لتصنيع النانوهياكل.
- يتضمن تثبيت الجزيئات الحيوية على الركائز.
- يستخدم SERS لفحص الجزيئات الحيوية.
- يعزز الحساسية من خلال الرنين البلازموني السطحي.
غرض الدراسة
- إنشاء أسطح انتقائية عالية للدراسات الجزيئية الحيوية.
- استكشاف الخصائص الهيكلية للجزيئات الحيوية.
- تطوير الأجهزة التي تتضمن واجهات نانوية حيوية.
الأساليب المستخدمة
- lithography الشعاع الإلكتروني لتصنيع الركيزة.
- تثبيت البروتينات والأبتامرات على الأسطح النانوية المنظمة.
- الطيف الرامانية المعزز بالسطح للتقييم.
- تفعيل الأسطح بطبقات جزيئية.
النتائج الرئيسية
- اكتشاف ناجح للبروتينات المثبتة باستخدام SERS.
- فحص تفاعلات البروتين-المادة المتفاعلة والأبتامر-المادة المتفاعلة.
- تبين زيادة الحساسية مقارنة بالأساليب التقليدية.
- قدم رؤى حول الخصائص الهيكلية للجزيئات الحيوية.
الاستنتاجات
- توفر الأسلوب أداة قوية لدراسة التفاعلات الجزيئية الحيوية.
- له تطبيقات محتملة في التشخيص الطبي والكشف البيئي.
- يجمع بين جوانب تصنيع النانو والكيمياء الحيوية والطيف.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) combined with electron beam lithography (EBL) enables detection of biomolecular interactions at nanostructured interfaces, supporting target validation through direct observation of binding events. This approach enhances sensitivity for low-abundance analytes, improving predictive confidence in early discovery by reducing false negatives in biomolecular screening. The method provides a reusable platform for assay development, allowing scalable evaluation of ligand binding across protein and aptamer-based systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct detection of protein-ligand and aptamer-ligand binding, supporting hypothesis interrogation and target de-risking.
- Operational Value: Provides label-free, quantitative readouts of binding affinity and specificity, reducing reliance on indirect assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible SERS spectra that reflect ligand-induced conformational changes, enabling assay standardization.
- Operational Value: Supports multiplexed screening via spatially addressable nanostructure arrays fabricated by EBL.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by capturing real-time biomolecular interactions in near-native conditions.
- Operational Value: Offers a pathway to translate in vitro binding data into predictive models for diagnostic or environmental sensing applications.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven target validation, followed by assay optimization for screening campaigns, and informing preclinical continuity through binding-derived structural insights.
- Discovery Biology: Supports target validation by visualizing binding-induced spectral shifts in immobilized biomolecules.
- Screening: Enables assay readiness through quantifiable, substrate-enhanced signals that scale across array formats.
- Analytics: Delivers vibrational fingerprint data that allows discrimination between bound and unbound states, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects binding data to potential biomarker applications via demonstrable ligand-specific spectral responses.
- Enterprise Reuse: Positions EBL-fabricated substrates as a regeneratable platform for repeated biomolecular screening cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, label-free observation of biomolecular recognition events.
- Operational Value: Enhances reproducibility via precise nanostructure fabrication and standardized immobilization protocols.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by improving early detection of non-binders and false positives.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on quantifiable binding metrics from SERS outputs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, surface chemistry, and Raman spectroscopy.
- Depends on access to electron beam lithography systems and optical Raman microscopes.
- Necessitates cross-functional standardization between fabrication, biofunctionalization, and analytical teams.
- Involves adaptation considerations for different biomolecules and immobilization chemistries.
- Includes practical limitations related to substrate stability, signal variability across nanostructure geometries, and ligand accessibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:04
Fabrication of Nano-patterned PMMA Masks Using Electron Beam Lithography (EBL)
3:47
Noble Metal Nanostructures Fabrication
4:41
Bio-functionalization of Substrates
8:14
Raman Spectroscopy
9:09
Results: Nanostructure-enabled SERS Spectra of Biopolymers
10:29
Conclusion
