تسيطر البيئة الميكروية للتحقيق ديناميكية الدم الحمراء تجميع خلية
يونيو 4, 2015
وصف بروتوكول تفاصيل إجراء التجارب لقياس خلايا الدم الحمراء (RBC) المجاميع تحت معدل القص للرقابة والمستمر، استنادا إلى تقنيات معالجة الصور. والهدف من هذا البروتوكول هو لربط RBC أحجام الركام إلى معدل القص المقابلة في بيئة الموائع الدقيقة التي تسيطر عليها.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مجاميع خلايا الدم الحمراء بشكل مباشر في دوران الأوعية الدقيقة ، ديناميكيا تحت معدلات قص خاضعة للرقابة وثابتة. يتم تحقيق ذلك من خلال التدريب أولا ، ومعلقات خلايا الدم الحمراء ، وقناة صغيرة مزدوجة y مع محلول ملحي عازل للفوسفات ، مما يخلق بهجة مستمرة في طبقة الدم. الخطوة الثانية هي تصور التدفق وتسجيله باستخدام كاميرا عالية السرعة.
بعد ذلك ، استخدم تقنيات معالجة الصور لمعالجة التسجيل والحصول على متوسط حجم التجميع وتوزيع الحجم الكلي في القناة الدقيقة. تتمثل الخطوة الأخيرة في تحديد سرعة الدم باتباع إزاحة جزيئات الفلورسنت المحقونة في القناة الدقيقة بين إطارين متتاليين. في النهاية ، يتم حساب معدل القص في القناة الدقيقة بناء على سرعة الدم وسمك طبقة الدم لربط أحجام الركام بمعدل القص المحلي المقابل.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل طريقة نقل الضوء ، هي أن مجاميع خلايا الدم الحمراء يتم تحليلها ديناميكيا في تدفق المشاركة المجهري بدلا من التقنيات الأخرى إحصائيا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأشعة الدموية ، مثل فهم ظروف تكوين مجاميع خلايا الدم الحمراء وإيجاد السلوك الإشعاعي للدم في الدورة الدموية الدقيقة. للبدء في تصنيع القنوات الدقيقة ، بعرض 120 ميكرون ، وارتفاع 60 ميكرون ، وطول سبعة ملليمترات وفقا لطرق الطباعة الحجرية الضوئية القياسية.
بعد ذلك ، اجمع خلايا الدم من المتبرعين المتطوعين الأصحاء وقم بإعداد معلقات خلايا الدم الحمراء بمستويات خمسة و 10 و 15٪ من الهيماتوكريت كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ، اجمع ملليلتر واحد من كل معلق لخلايا الدم الحمراء مع 60 ميكرولترا من محلول 1٪ يحتوي على جزيئات تتبع الفلورسنت. رج الأنبوب برفق لخلط المحلول. اجمع أيضا نفس الحجم من جزيئات التتبع مع مليلتر واحد من PBS عند درجة حموضة 7.4.
قم بتحميل حقنة زجاجية سعة 25 ميكرولتر بمحلول التتبع الذي يحتوي على خلايا الدم الحمراء وحقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر. باستخدام حل التتبع في PBS ، تأكد من عدم وجود فقاعات في النظام. بعد ذلك ، ضع القناة الدقيقة على مرحلة مجهر مقلوب متصلة بكاميرا عالية السرعة قادرة على تسجيل 18 إطارا في الثانية أو أكثر ، ونظام قياس سرعة صورة الجسيمات الدقيقة.
قم بتوصيل كل حقنة عبر الأنبوب بأحد منافذ مدخل قناة الموائع الدقيقة ثم قم بتحميلها في حامل نفس مضخة الحقنة. قم ببرمجة مضخة الحقنة لتوزيع المحقنة سعة 25 ميكرولتر بمعدل ميكرولتر في الساعة. سيؤدي ذلك أيضا إلى توزيع حقنة 100 ميكرولتر بأربعة أضعاف هذا المعدل بسبب اختلاف حجمها.
قم بتغيير معدل التدفق بين التجارب لاختبار معدلات القص المختلفة. استخدم سخرية المعايرة مع وضع العدسة 20 × لمعايرة الكاميرا عالية السرعة. ثم ابدأ تشغيل المضخة لبدء توزيع المحاللين في القناة الدقيقة.
تحديد التعرض الأمثل للكاميرا. حان الوقت للتصوير الواضح للركام. من المهم الانتظار حتى يصل التدفق إلى حالة مستقرة قبل الحصول على أي قياسات.
إذا تم الوصول إلى الحالة المستقرة الآن في غضون ثلاث إلى خمس دقائق. أعد ملء المحقنة لتثقيف الخليط والحفاظ على خلايا الدم الحمراء في حالة تعليق. بمجرد الوصول إلى تدفق الحالة المستقرة ، ابدأ في تسجيل حركة خلايا الدم الحمراء.
سجل التدفق لمدة سبع ثوان. باستخدام برنامج قادر على معالجة الصور ، قم بتحسين التباين لكل صورة بمقياس رمادي تم التقاطها باستخدام طريقة معادل الرسم البياني. بعد ذلك ، قم بتحويل الصور ذات التدرج الرمادي إلى صور ثنائية.
قم بتعيين قيمة الحد بعناية عن طريق اختبار العديد من القيم واختيار القيمة التي تم اكتشاف جميع التجميعات لها بشكل صحيح. إذا لزم الأمر ، املأ الثقوب المقابلة للفجوات داخل ركام واحد. ثم اكتشف الخلايا عن طريق تحديد وحدات البكسل البيضاء المجاورة في الصورة الثنائية بحيث يتم احتساب الخلايا المجاورة على أنها مجاميع.
قم بتسمية مجاميع خلايا الدم الحمراء المختلفة التي تم اكتشافها ، ثم قم بتحويل الصورة الثنائية إلى صورة حمراء وزرقاء خضراء للحصول على تصور أفضل. أخيرا ، قم بتراكب الصورة الحمراء والخضراء الزرقاء على الصورة الأصلية. للتحقق من كفاءة معالجة الصور ، احسب مساحة كل تجميع تم اكتشافه في الإطار بناء على عدد وحدات البكسل المكتشفة.
قم بمعالجة جميع الإطارات بنفس الطريقة. بعد ذلك، قم بحساب متوسط أحجام التجميع المكتشفة في كل إطار، ثم نتائج جميع الإطارات. للحصول على متوسط الحجم الكلي لكل تسجيل لمحركات تعليق خلايا الدم الحمراء ، قم بتحويل النتائج إلى ميكرومتر مربع باستخدام صورة السخرية.
ثم احسب مساحة خلية دم حمراء واحدة لتحديد ممثل. العدد المقدر لخلايا الدم الحمراء داخل كل تراكم تم اكتشافه بمجرد الحصول على البيانات. باستخدام الكاميرا عالية السرعة ، قم بالتبديل إلى الكاميرا النبضية المزدوجة المستخدمة في نظام قياس سرعة صور الجسيمات الدقيقة.
استخدم برنامج تصوير مثل البرنامج الموضح هنا للحصول على صورة التدفق ومعالجة الصور لتحديد مجال السرعة. تأكد من ارتداء نظارات واقية ثم تشغيل نظام الليزر والكاميرا. ضع ميكرومتر تحت المجهر واستخدم الصورة الناتجة لمعايرة النظام.
ثم ابدأ تدفق السوائل وتصور الجسيمات في كلا السائلين. أوجد المستوى الأوسط للقناة الدقيقة من خلال التركيز على أسرع الجسيمات وأكثرها سطوعا في التدفق. بعد ذلك ، اضبط الفاصل الزمني بين الإطارات على حوالي مللي ثانية بحيث تتحرك أسرع الجسيمات من خمسة إلى 10 بكسل بين كلتا الصورتين وتبدأ في تسجيل التدفق O.اضبط البرنامج للحصول على 100 زوج من الصور لجميع معلقات خلايا الدم الحمراء المختلفة ولمعدلات القص المختلفة.
بعد المعالجة المسبقة للصورة. اختر حجم نافذة الارتباط وشكلها بالإضافة إلى النسبة المئوية للصور المتداخلة. عبر عن النتائج كحقل متوسط سرعة محسوب من 100 زوج من الصور وجذر متوسط الخطأ التربيعي في السرعة.
قم بإيقاف تشغيل كاميرا الليزر والكمبيوتر. بمجرد إجراء جميع القياسات ومعالجة الصور ، احسب المعدل الهائل عن طريق اكتشاف وتقدير سمك الدم أولا في القناة الدقيقة بناء على تسجيل الكاميرا عالية السرعة. لهذا الغرض ، قم بحساب متوسط جميع الإطارات في التسجيل المحدد للحصول على صورة خلفية للفيديو.
أخيرا ، قم بإزالة طبقة الدم عن طريق فحص الصورة المتوسطة لجميع الإطارات بصريا واكتشاف حافة طبقة الدم يدويا. ثم احصل على قيمة السرعة لسمك طبقة الدم المقابلة يدويا من ملف تعريف السرعة المستخرج ، واحسب معدل القص بقسمة قيمة السرعة على طبقة الدم. السماكة الموضحة هنا هي الحركات الصافية لأربعة مجاميع خلايا الدم الحمراء التي تم اكتشافها في ثلاثة إطارات متتالية.
تظهرالمجاميع الكبيرة لأكثر من 30 خلية باللون الأحمر. تظهر المجاميع المتوسطة بين تسع و 30 خلية باللون الأخضر ، وتظهر مجاميع صغيرة من أقل من تسع خلايا باللون الأزرق. تختلف سرعة الركام بناء على موقعه في القناة الدقيقة الموضحة.
فيما يلي ملامح سرعة خلايا الدم الحمراء المعلقة عند 5٪ هيماتوكريت و 10٪ هيماتوكريت و 15٪ هيماتوكريت بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الساعة. يمكنك رؤية رأس السرعة نحو الصفر عند كلا الحافتين كما هو متوقع ، وتختلف نقطة الانعطاف بين تياري التدفق قليلا بين مستويات الهيماتوكريت حيث يزيد معدل القص الكلي من حجم الركام في كل انخفاض في مستوى الهيماتوكريت. ويرجع ذلك إلى القوة الهائلة في القناة الدقيقة التي تتجاوز قوة التجميع مما يتسبب في تفكك خلايا الدم الحمراء.
أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ضمان جودة صورة جيدة للتدفق في القناة الدقيقة وضمان تباين بين خلايا الدم الحمراء المتدفقة وخلفية الصورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل مجاميع خلايا الدم الحمراء نوعيا وكميا في ظل ظروف التدفق الخاضعة للرقابة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يحدد هذا البروتوكول طريقة لتحديد حجم تكتلات خلايا الدم الحمراء (RBC) تحت معدلات قص محكومة باستخدام تقنيات معالجة الصور. يهدف هذا الدراسة إلى ربط أحجام تكتلات خلايا الدم الحمراء بمعدلات القص في بيئة ميكروفلويدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكروفلويديك
- علم الدم
- معالجة الصور
الخلفية
- تلعب تكتلات خلايا الدم الحمراء دورًا حيويًا في دوران الأوعية الدقيقة.
- فهم معدلات القص ضروري لدراسة ديناميكيات تدفق الدم.
- تقنيات معالجة الصور يمكن أن تعزز تحليل تكتلات خلايا الدم الحمراء.
- تستخدم هذه الدراسة إعداد قناة ميكروية للتجارب المحكومة.
غرض الدراسة
- تحديد حجم تكتلات خلايا الدم الحمراء في بيئة ميكروفلويدية.
- ربط أحجام التكتلات بمعدلات القص المحلية.
- تحسين فهم سلوك تدفق الدم في دوران الأوعية الدقيقة.
الطرق المستخدمة
- تحضير معلقات خلايا الدم الحمراء في محلول ملحي فوسفات.
- تصور التدفق باستخدام كاميرا عالية السرعة.
- معالجة الصور لتحديد متوسط حجم التكتلات وتوزيعها.
- حساب معدل القص بناءً على سرعة الدم وسمك الطبقة.
النتائج الرئيسية
- التحديد الناجح لأحجام تكتلات خلايا الدم الحمراء.
- تأسيس علاقة بين أحجام التكتلات ومعدلات القص.
- مظاهرة الاستخدام الفعال لتقنيات معالجة الصور.
- رؤى حول ديناميكيات سلوك خلايا الدم الحمراء في دوران الأوعية الدقيقة.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة تكتلات خلايا الدم الحمراء.
- تعزز النتائج فهم تدفق الدم في الأنظمة الميكروفلويدية.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية دراسات على اضطرابات الدم والعلاجات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to RBC aggregation pathways and modulators of hemorheological function.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization and quantification of aggregate dynamics under physiologically relevant shear conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible aggregate size metrics under controlled flow.
- Operational Value: Enhances assay standardization and scalability through microfluidic platform reuse and quantitative image-based readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity by modeling shear-dependent RBC behavior in microcirculation.
- Operational Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by correlating aggregate stability with hemodynamic conditions relevant to vascular function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic observation of aggregate formation and dissociation under controlled shear rates.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microfluidic environments and quantitative aggregate size distribution outputs.
- Analytics: Provides measurable readouts including average aggregate size, size distribution, and localized shear rate calculations derived from velocity fields and layer thickness.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RBC behavior in microvascular environments relevant to disease states.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating compounds or conditions affecting hemorheological properties across multiple hematocrit levels and shear conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RBC-plasma interactions under flow.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through controlled shear rates, calibrated imaging, and automated image processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hemorheological liabilities that could impact drug safety or efficacy.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modulate aggregation propensity in a shear-dependent manner.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, high-speed imaging, and image processing techniques for binary thresholding and particle labeling.
- Depends on microfluidic fabrication capabilities, high-speed cameras capable of ≥18 fps, and μPIV systems for velocity field determination.
- Necessitates cross-team standardization of hematocrit preparation, tracer particle concentration, and flow rate protocols to ensure comparability across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to diseased RBC samples or varying plasma conditions that may alter aggregation kinetics.
- Includes practical limitations such as the need for bubble-free systems, steady-state flow validation, and manual validation of blood layer thickness for shear rate calculation.
