تسيطر البيئة الميكروية للتحقيق ديناميكية الدم الحمراء تجميع خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو القياس الكمي المباشر لتجمعات خلايا الدم الحمراء في الدورة الدموية الدقيقة، وبشكل ديناميكي تحت معدلات قص ثابتة ومتحكم بها. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تدفق معلقات خلايا الدم الحمراء، ومحلول منظم من فوسفات الصوديوم، في قناة دقيقة مزدوجة على شكل حرف y، مما يخلق قوة قص ثابتة في طبقة الدم. وتتمثل الخطوة الثانية في تصوير وتسجيل التدفق باستخدام كاميرا عالية السرعة.

بعد ذلك، تُستخدم تقنيات معالجة الصور لمعالجة التسجيل والحصول على متوسط حجم التجمعات وتوزيع أحجام التجمعات داخل القناة الدقيقة. وتتمثل الخطوة النهائية في تحديد سرعة الدم من خلال تتبع إزاحة الجسيمات الفلورية المحقونة في القناة الدقيقة بين إطارين متتاليين. وفي النهاية، يتم حساب معدل القص في القناة الدقيقة بناءً على سرعة الدم وسُمك طبقة الدم لربط أحجام التجمعات بمعدل القص المحلي المقابل لها.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل طريقة نفاذية الضوء في أنه يتم تحليل تجمعات خلايا الدم الحمراء ديناميكياً في التدفق القصي المجهري، بدلاً من تحليلها إحصائياً كما هو الحال في التقنيات الأخرى. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الأشعة الدموية، مثل فهم ظروف تكوين تجمعات خلايا الدم الحمراء واكتشاف السلوك الإشعاعي للدم في الدورة الدموية الدقيقة. وللبدء، يتم تصنيع قنوات مجهرية بعرض 120 microns، وارتفاع 60 microns، وطول سبعة مليمترات وفقاً لطرق الطباعة الضوئية القياسية.

بعد ذلك، اجمع خلايا الدم من متطوعين أصحاء وقم بتحضير معلقات من خلايا الدم الحمراء بمستويات هيماتوكريت تبلغ 5% و 10% و 15% كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق، ثم اخلط 1 mL من كل معلق لخلايا الدم الحمراء مع 60 µL من محلول بتركيز 1% يحتوي على جسيمات تتبع فلورية. رج الأنبوب برفق لخلط المحلول. كما يتم خلط نفس الحجم من جسيمات التتبع مع 1 mL من PBS عند pH 7.4.

املأ محقنة زجاجية سعة 25 microliter بمحلول التتبع الذي يحتوي على خلايا الدم الحمراء، ومحقنة زجاجية أخرى سعة 100 microliter. مع وجود محلول التتبع في PBS، تأكد من عدم وجود فقاعات في النظام. بعد ذلك، ضع القناة الدقيقة على منصة مجهر مقلوب متصلة بكاميرا عالية السرعة قادرة على تسجيل 18 إطاراً في الثانية أو أكثر، ونظام قياس سرعة الصور للجسيمات الدقيقة.

قم بتوصيل كل حقنة عبر أنابيب إلى أحد منافذ الإدخال في القناة الموائع الدقيقة، ثم قم بتحميلها في حامل مضخة الحقن نفسها. برمج مضخة الحقن لتفريغ الحقنة سعة 25 µL بمعدل 2 µL في الساعة. سيؤدي ذلك أيضًا إلى تفريغ الحقنة سعة 100 µL بمعدل يعادل أربعة أضعاف هذا المعدل نظرًا لاختلاف حجمهما.

قم بتغيير معدل التدفق بين التجارب لاختبار معدلات قص مختلفة. استخدم مسطرة معايرة مع وضع العدسة 20x لمعايرة الكاميرا عالية السرعة. ثم قم بتشغيل المضخة لبدء توزيع المحلولين داخل القناة الميكرونية.

حدد وقت التعريض الأمثل للكاميرا للحصول على صور واضحة للتجمعات. من المهم الانتظار حتى يصل التدفق إلى الحالة المستقرة قبل إجراء أي قياسات.

يتم الآن الوصول إلى الحالة المستقرة في غضون ثلاث إلى خمس دقائق. أعد ملء السرنجة لترطيب الخليط والحفاظ على خلايا الدم الحمراء في حالة تعليق. بمجرد الوصول إلى تدفق الحالة المستقرة، ابدأ في تسجيل حركة خلايا الدم الحمراء.

قم بتسجيل التدفق لمدة سبع ثوانٍ. وباستخدام برنامج قادر على معالجة الصور، قم بتحسين التباين لكل صورة تدرج رمادي تم التقاطها باستخدام طريقة موازن الهيستوجرام. بعد ذلك، قم بتحويل صور التدرج الرمادي إلى صور ثنائية.

قم بتعيين قيمة العتبة بدقة من خلال اختبار عدة قيم واختيار القيمة التي يتم عندها رصد جميع التجمعات بشكل صحيح. وإذا لزم الأمر، قم بملء الفجوات المقابلة للفراغات الموجودة داخل التجمع الواحد. بعد ذلك، قم برصد الخلايا عن طريق تحديد البكسلات البيضاء المتجاورة في الصورة الثنائية بحيث يتم احتساب الخلايا المتلاصقة كأنها تجمعات.

قم بتصنيف تجمعات خلايا الدم الحمراء المختلفة التي تم رصدها، ثم حول الصورة الثنائية إلى صورة بنظام الألوان الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) لتحسين التصور البصري. وأخيراً، قم بدمج صورة RGB فوق الصورة الأصلية. ومن أجل التحقق من كفاءة معالجة الصور، احسب مساحة كل تجمع تم رصده في الإطار بناءً على عدد البكسلات المكتشفة.

قم بمعالجة جميع الإطارات بنفس الطريقة. بعد ذلك، احسب متوسط أحجام التجمعات المكتشفة في كل إطار، ثم متوسط النتائج لجميع الإطارات. وللحصول على متوسط حجم التجمعات لكل تسجيل من محركات معلقات كرات الدم الحمراء، قم بتحويل النتائج إلى ميكرومتر مربع باستخدام الصورة المرجعية.

ثم احسب مساحة خلية دم حمراء واحدة لتحديد قيمة ممثلة. قم بتقدير عدد خلايا الدم الحمراء داخل كل تجمع تم رصده بمجرد الحصول على البيانات. باستخدام الكاميرا عالية السرعة، انتقل إلى الكاميرا ذات النبض المزدوج المستخدمة في نظام قياس سرعة الصور للجسيمات الدقيقة.

استخدم برنامج تصوير مثل البرنامج الموضح هنا لالتقاط صور التدفق ومعالجة الصور لتحديد مجال السرعة. تأكد من ارتداء نظارات واقية ثم قم بتشغيل نظام الليزر والكاميرا. ضع ميكرومتر تحت المجهر واستخدم الصورة الناتجة لمعايرة النظام.

ثم ابدأ بتدفق السوائل وتصور الجسيمات في كلا السائلين. حدد المستوى المتوسط للقناة الدقيقة من خلال التركيز على أسرع الجسيمات وأكثرها سطوعاً في التدفق. بعد ذلك، اضبط الفاصل الزمني بين الإطارات ليكون حوالي 2ms بحيث تتحرك أسرع الجسيمات بمقدار 5 إلى 10 بكسل بين الصورتين، وابدأ بتسجيل التدفق O. اضبط البرنامج لالتقاط 100 زوج من الصور لجميع معلقات خلايا الدم الحمراء المختلفة ولمعدلات قص مختلفة.

بعد المعالجة المسبقة للصور، اختر حجم وشكل نافذة الارتباط، بالإضافة إلى نسبة تداخل الصور. عبّر عن النتائج في شكل مجال سرعة متوسط يتم حسابه من 100 زوج من الصور، وجذر متوسط مربع الخطأ في السرعة.

أوقف تشغيل كاميرا الليزر وجهاز الكمبيوتر. بمجرد الانتهاء من جميع القياسات ومعالجة الصور، احسب معدل القص عن طريق تحديد وتقدير سمك الدم في القناة الدقيقة أولاً بناءً على تسجيل الكاميرا عالية السرعة. ولهذا الغرض، قم بحساب متوسط جميع الإطارات في التسجيل المحدد للحصول على صورة خلفية للفيديو.

أخيرًا، قم بتحديد طبقة الدم من خلال الفحص البصري للصورة المتوسطة لجميع الإطارات والكشف يدويًا عن حافة طبقة الدم. ثم استخرج يدويًا قيمة السرعة المقابلة لسُمك طبقة الدم من ملف تعريف السرعة المستخلص، واحسب معدل القص بقسمة قيمة السرعة على سُمك طبقة الدم. تمثل قيم السُمك الموضحة هنا صافي حركات أربعة تجمعات من خلايا الدم الحمراء التي تم الكشف عنها في ثلاثة إطارات متتالية.

تظهر التجمعات الكبيرة التي تضم أكثر من 30 خلية باللون الأحمر. وتظهر التجمعات المتوسطة التي يتراوح عدد خلاياها بين تسع و30 خلية باللون الأخضر، بينما تظهر التجمعات الصغيرة التي تضم أقل من تسع خلايا باللون الأزرق. وتختلف سرعة التجمع بناءً على موضعه في القناة الدقيقة الموضحة.

إليكم ملفات تعريف السرعة لخلايا الدم الحمراء المعلقة عند نسبة هيماتوكريت 5%، و10%، و15% بمعدل تدفق قدره 10 microliters لكل ساعة. يمكنكم ملاحظة انخفاض السرعة نحو الصفر عند كلا الحافتين كما هو متوقع، كما تختلف نقطة الانقلاب بين تيارَي التدفق قليلاً باختلاف مستويات الهيماتوكريت، حيث يؤدي ارتفاع معدل القص الإجمالي إلى انخفاض حجم التجمعات في كل مستوى من مستويات الهيماتوكريت. ويعود ذلك إلى تجاوز قوة القص في القناة الدقيقة لقوة التجميع، مما يؤدي إلى تفكك خلايا الدم الحمراء.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ضمان جودة صورة جيدة للتدفق في القناة الدقيقة، وضمان وجود تباين بين خلايا الدم الحمراء المتدفقة وخلفية الصورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل تجمعات خلايا الدم الحمراء نوعياً وكمياً تحت ظروف تدفق مضبوطة.