في فيفو ديناميات الشبكية دبقية التنشيط خلال تنكس عصبي: متحد البؤر Ophthalmoscopic التصوير والقياس الشكلي خلية في الماوس الزرق

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف ديناميكيات الخلايا الدبقية الصغيرة في نموذج فأر مصاب بالجلوكوما المزمنة عن طريق التصوير البؤري الحي لشبكية العين. ويتم تحقيق ذلك من خلال تنظير العين البؤري الشهري غير الجراحي أو التصوير المقطعي المسحي الليزري (CSLO) لرؤية الخلايا الدبقية الصغيرة الفلورية على الشبكية ورأس العصب البصري. ويقوم تحليل الصور الحية، باستخدام تقسيم جسم الخلية القائم على العتبة والقياسات المورفولوجية، بتحديد التغيرات في عدد الخلايا الدبقية الصغيرة ومستوى تنشيطها.

تظهر النتائج أن التصوير الشهري باستخدام مجهر المسح الليزري متحد البؤر (CSLO) في الفئران الحية يمكن استخدامه لمراقبة حركية توزيع كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيطها المورفولوجي خلال المراحل المبكرة من تطور التنكس العصبي المزمن. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التصوير البؤري ثنائي الفوتون للخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ GFP في دماغ الفأر، في أن تصوير الشبكية بواسطة CSLO يسمح بالملاحظة والمراقبة المباشرة للخلايا الدبقية الصغيرة طوال فترة تطور الاضطرابات التنكسية العصبية المرتبطة بالشيخوخة في الكائن الحي السليم. لقد خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد أن أثبتنا خارج الجسم الحي (ex vivo)، أن الخلايا الدبقية الصغيرة أظهرت تنشيطاً وتجمعاً مكثفاً في المنطقة المركزية لدى فئران DBA through J الصغيرة في أعمار تسبق ظهور التنكس العصبي القابل للكشف.

من أجل التساؤل عما إذا كانت هذه التغيرات المناعية الفطرية المبكرة التي سبقت ظهور الجلوكوما القابلة للكشف قد تسببت في التنكس العصبي، كان علينا وضع نهج حي (in vivo) لتتبع التغيرات في الخلايا الدبقية الصغيرة. وسيقوم سيزار روميرو، الفني في مختبري، باستعراض إجراء الحصول على الصور الحية. لبدء العمليات، قم بتشغيل نظام CSLO وأدخل معلومات الجلسة. بعد ذلك، استعد للتصوير بشكل آمن.

قم بتركيب عدسة شيئية ذات مجال واسع بزاوية 55 درجة نظيفة. ضع الفأر فوق منصة التصوير بعد دقيقتين من إعطاء المخدر، ثم قم بتوسيع حدقتي العينين باستخدام قطرات الميدرياتيك. بعد خمس دقائق، تحقق من أن الفأر في حالة تخدير تام.

بعد ذلك، قم بتغطية كل عين بالعدسات اللاصقة باستخدام أقل قدر من الضغط. وجه الفأر بحيث تتقابل العين اليمنى مع العدسة الشيئية ويكون المحجر موازياً للعدسة. لا يلزم تقييد الحيوان، ولكن يجب الحفاظ عليه على مسافة ثابتة من العدسة الشيئية.

بينما تظل العين محاذية للجهاز لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة القادمة، لن يتحرك الفأر أو يرمش بينما يتم تتبع حركات عينه بواسطة نظام التصوير الحي CSLO. ابدأ جلسة التصوير بجمع منظر لقاع الشبكية الداخلية. ومن أجل ذلك.

اختر وضع الأشعة تحت الحمراء، والذي يتوافق مع طول موجي للإثارة يبلغ 820 nanometers. ثم اضبط قدرة الليزر على 100% والحساسية لتكون بين 40 و60%. بعد ذلك، وبسرعة عالية، حدد موقع العين باستخدام عصا التحكم لتوجيه منظار العين، واستعد لجمع صورة لقاع العين للقرص البصري والأوعية الدموية الشبكية. افحص القرنية والعدسة بحثاً عن أي إصابة أو عتامة.

يجب استبعاد العيون التي تعاني من عيوب أو إصابات قد تؤثر على عملية الحصول على الصور من الدراسة. والآن، من خلال تقريب العدسة الشيئية من العين، حدد منطقة القرص البصري، وهي سطح رأس العصب البصري أو ONH. ثم قم بتوسيط الصورة على الـ ONH.

يعد وضع رأس العصب البصري (ONH) بشكل صحيح أمراً أساسياً للحصول على تركيز وتوهين متساويين عبر الصورة. الخطوة التالية هي تصور المستويات الداخلية للشبكية بالإضافة إلى رأس العصب البصري (ONH). لاستخدام مستوى بؤري مرجعي، استعن بالأوعية الدموية الرئيسية الموجودة على السطح الزجاجي للشبكية، وهو ما يتوافق مع 59 و60 ديوبتر، أو حتى في مستويات أعمق عند 55 ديوبتر في مناطق القرص البصري المقعرة.

بعد ذلك، اضبط تشبع الصورة باستخدام المقبض الموجود في لوحة اللمس حتى يمتد هالة بيضاء من الإضاءة لتغطي معظم قاع العين حول القرص البصري. ثم اختر درجة التشبع الأدنى التي تعطي هالة موحدة تشير إلى التباين الأمثل لتلك العين. قد يكون من الضروري إعادة محاذاة الكاميرا إذا استمر وجود مناطق مظلمة.

الآن، قم بالتقاط صورة عالية الدقة لقاع العين للمنطقة المركزية من الشبكية عن طريق حساب متوسط 30 إطاراً تم التقاطها في الوقت الفعلي لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. وهذا يعادل 4.7 إطارات في الثانية، مع إجراء معايرة فورية وفي نفس الموضع المجهز لالتقاط صورة فلورية للخلايا الموجبة لـ GFP. انتقل إلى وضع التصوير الفلوري في لوحة شاشة اللمس، والذي يختار الليزر الأزرق باستثارة ليزر بطول موجي 488 nanometer ومجموعة مرشحات حاجزة من 460 إلى 490 nanometer، واضبط عملية الاستحواذ على قدرة ليزر 100% وحساسية من 100 إلى 125%.

قم الآن بجمع صورة فلورية ثنائية الأبعاد لنقطة XY واحدة للعصب البصري (ONH) بمتوسط 100 مسحة (scans). بعد ذلك، التقط صورة متعددة النقاط للشبكية حول العصب البصري (ONH)، وحدد خيار "composite" في لوحة التحكم، ثم حرك منظار العين عبر المحور الأنفي الصدغي. يقوم البرنامج تلقائياً بحساب متوسط المناطق الممسوحة حديثاً ودمجها في الوقت الفعلي.

إذا كانت جودة صورة مناطق الشبكية غير كافية للسماح بإجراء المتوسط، فإن الدائرة الخضراء التي تحدد المنطقة التي يتم مسحها ستتحول إلى اللون الأحمر. وتغطي الصورة المركبة الناتجة مساحة تصل إلى 1.7 في أربعة مليمترات. ويجب توخي الحذر أثناء عملية الحصول على الصورة المركبة.

يمكن أن تُفقد الصور ذات الدقة العالية عند تحريك الشيئية بسرعة كبيرة قبل اكتمال عملية متوسط المسح وتجميع الصور. وعندما يبدأ مفعول التخدير في التلاشي، يجب إنهاء جلسة التصوير لأن الفأر يبدأ في التنفس بعمق، مما يجعل التصوير غير عملي. ابدأ بمحاذاة صور قاع العين بالتتابع لسلسلة زمنية باستخدام الأوعية الدموية والقرص البصري كعلامات استدلالية.

باستخدام برنامج تقليدي لتحرير الصور، قم بمحاذاة جميع الصور حتى تتداخل نقاط الـ O hs الخاصة بها. ستكون الصورة العلوية شبه شفافة أثناء سحبها. بعد ذلك، قم بتدوير كل صورة في التسلسل حتى تتطابق الأوعية الدموية الرئيسية فيها مع الأوعية الدموية في الصورة السابقة، ثم احفظ هذا الترتيب للرجوع إليه مستقبلاً.

سجل الزاوية المصححة لكل صورة وقم بتطبيقها على صورة الفلورية لنقطة XY المنفردة المقابلة. الآن يمكن تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية لـ GFP والمتمركزة في الشبكية المركزية عن طريق فتح ملفات TIFF المحاذات في برنامج Fluor render. ولعرض جميع الخلايا، اجعل الصورة تملأ الشاشة وقم بتعيين عرض الرندر (render view) على الوضع المركب المتعامد والمستكمل (composite orthogonal and interpolated).

ثم حدد الخصائص 0.58 gamma و 255 saturation point و 255 luminance و 195 alpha عند 1.00 shading. استكمل الاختيارات بتحديد كل من قناتي RG كقنوات مرئية. أخفِ القناة B بالنقر المزدوج عليها في إطار مساحة العمل لتجزئة الخلايا الفردية.

قم باختيار القناة الحمراء وتطبيق العتبة (threshold) عن طريق زيادة العتبة الدنيا حتى يتم قناع أغلبية الخلايا بأقل قدر من التداخل واستبعاد استطالات الخلايا مع الحفاظ على ثبات العتبة العليا. وأخيرًا، احفظ الملف الذي يحتوي على الخلايا المقنعة باستخدام أمر الالتقاط (capture). افتح الصورة التي تحتوي على الخلايا المقنعة في محرر الرسوم النقطية هناك.

قم بعكس المقياس الرمادي للملاحظة المباشرة واضبط الدقة لتكون 300 DPI أو أكثر. يتم حفظ صورة RGB كملف TIF. الخطوة التالية من تحليل الصور الحية تتعلق بالخلايا الدبقية الصغيرة، لذا يتم إجراء التقسيم والتحليل المورفولوجي لتحديد SATA لغرض قياس المساحة.

استخدم برنامجاً قادراً على قياس الكثافة وعدّ الأجسام بناءً على قيمة العتبة. افتح ملف TIFF الذي يحتوي على الخلايا المجزأة، واختر إعادة تحجيم spline للحصول على أقصى دقة، وحدد القناة الحمراء كأبيض وأسود لتحسين التصور. بعد ذلك، قم بمعايرة الصورة من خلال تحديد قطرها الأفقي بما يتراوح بين 1.4 إلى 1.7 millimeters اعتماداً على العمر لتجزئة الخلايا الفردية.

لذا يا MA، قم بتطبيق عتبة الكثافة على القناة الحمراء. افتح دالة عتبة الكثافة ضمن أمر تعداد الأجسام وتحديث الحساب. استخدم هذه الدالة لتتبع المعلمات ثنائية الأبعاد لكل عتبة من منطقة الاهتمام التي تمثل الفرد.

بعد ذلك، حدد عتبة الكثافة في المدرج التكراري للكثافة. اختر أدنى 50 إلى 60% من مستويات 255 وقم بتنقيح قيمة العتبة النهائية للخلايا الفردية. قيم بصرياً مدى التداخل بين قناع لون العتبة باللون الأزرق ومحيط جسم الخلية باللون الرمادي باستخدام عناصر التحكم في شريط أدوات الثنائي أو فهرس الكائنات.

حدد يدويًا مناطق الاهتمام الجسدية التي تحتوي على خلايا متعددة. قم بفصل هذه العناصر عن طريق فصل مناطق الاهتمام. وأثناء القيام بذلك، استخدم زر التبديل لتصور الخلايا مباشرة الآن باستخدام تقييد المنطقة.

صنف الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها منشطة إذا كانت مساحة أجسامها أكبر من 50 إلى 60 ميكرون مربع. وصنف الخلايا الدبقية الصغيرة على أنها غير منشطة إذا كانت أجسامها أصغر.

أخيرًا، تحقق من العملية وافحص تعقيد التفرع في كل خلية دبقية صغيرة منشطة عن طريق دمج قناع الجسم الخلوي وصورة النقطة XY الواحدة مع زيادة التباين بنسبة 50%. استُخدم البروتوكول الموصوف لتصوير الخلايا الدبقية الصغيرة عبر منطقة واسعة من الشبكية المركزية. في فئران DBA two J الصغيرة متغايرة الزيجوت التي تعبر عن CX three C one GFP، أتاح الجمع بين دقة الخلايا العالية والتصوير الحي وتحديد العتبة والتحليل المورفومتري التقسيم التلقائي للخلايا الفردية الموجبة لـ GFP، وبالتالي تم تمييز الخلايا بناءً على المساحة. تمثل فئران DBA two J نموذجاً للجلوكوما المزمنة، وتم تصويرها شهرياً لمراقبة تطور الدباق الدبقي الموضعي وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الأعمار التي تسبق التحلل العصبي القابل للكشف، بما يتفق مع التقدم المتغير للتحلل العصبي في العيون الفردية. وكشف هذا التحليل عن تغيرات في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في الشبكية والدباق الدبقي مع مرور الوقت.

كما كشف التحليل عن تغيرات ديناميكية في كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة الكلية والمنشطة داخل كل شبكية على حدة. ولم تكن كثافة مجموعة الخلايا الدبقية الصغيرة مرتبطة بالتغيرات في كثافة الخلايا التي تعبر عن GFP، وهو ما يتوافق مع نتائج أخرى. وبناءً على ذلك، يمكن استخدام تحليل CSLO كمؤشر على التطور المبكر للمرض.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحسين مستويات التشبع للصور الفلورية لبروتين GFP مع الخلايا الدبقية الصغيرة (microglia)، المتمركزة في الشبكية الداخلية، بعناية؛ حيث تعتمد إمكانية تكرار صور CSLO للشبكية المركزية، وكذلك الاتساق في التفاصيل الخلوية المكتشفة عبر الشبكية المركزية، بشكل حاسم على هذه الخطوة بعد تطويرها. يتم تطبيق بروتوكول التصوير الحي هذا في مختبرنا للتحقق من الرابط المحتمل بين التغيرات المبكرة في الخلايا الدبقية الصغيرة للشبكية ورأس العصب البصري، والتطور اللاحق للمياه الزرقاء (الجلوكوما) في نماذج DBA/2J ونماذج أخرى من التنكس الشبكي المزمن. قد تسمح استراتيجية التصوير الحي هذه أيضاً بالكشف المبكر عن اعتلالات مزمنة أخرى تستهدف الشبكية والعصب البصري بالتنكس، مثل التصلب المتعدد ومرض ألزهايمر ومرض باركنسون.