عزل الخلايا الجذعية العصبية / السلف من المنطقة المحيطة بالبطين في الجرذان الكبار والحبل الشوكي البشري

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المجاورة للبطين للفأر البالغ أو الحبل الشوكي البشري. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الحبل الشوكي أولا عن طريق استئصال الصفيحة الفقرية. الخطوة الثانية هي قطع الحبل الشوكي بشكل عرضي إلى أجزاء سنتيمتر واحد وتشريح المنطقة المجاورة للبطينين من كل جزء من الحبل الشوكي.

بعد ذلك ، يتم تقطيع الأنسجة المفرومة إلى قطع ملليمتر واحد ثم يتم فصلها إنزيميا. الخطوة الأخيرة هي فصل الخلايا السليمة عن طريق الطرد المركزي من خلال تدرج كثافة متقطع ولوحة تعليق الخلية. في النهاية ، يمكن تقييم تكوين المجال العصبي ونمو الخلايا الجذعية العصبية باستخدام الفحص المجهري المناعي.

سأوضح اليوم كيفية عزل الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المجاورة للبطين في الحبل الشوكي للفئران البالغة. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الخلايا للمساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية العصبية ، مثل العوامل الخارجية التي تعزز تقييد النسب أو كيف تستجيب هذه الخلايا للمنبهات أو الإجهاد المختلفة. للبدء ، قم بإعداد المخازن المؤقتة للثقافة والوسائط والتشريح كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

بعد ذلك ، بعد جرعة زائدة من التخدير ، قم بتعقيم جلد الفئران واستخدم مقص تشريح كبير لإزالة السطح الظهري ، مما يؤدي إلى تعريض العمود الفقري. أمسك مقص التشريح بشكل عمودي على السطح الظهري وبشكل عرضي. قطع العمود الفقري فوق الأطراف الخلفية.

ثم استخدم مقصا أصغر لقطع العضلة الظهرية التي تعلو العمود الفقري طوليا في اتجاه منقاري لفضح العمليات الشائكة التي تبدأ من نهاية التدليل المكشوف. أدخل أداة قطع العظام الحادة الصغيرة خارج الفم في الجانب الجانبي للقناة الشوكية في الفراغ بين الحبل الشوكي والعمود الفقري. ضع الشفرة ضحلة وموازية للسلك.

ثم قم بعمل قطع صغيرة في الصفيحة وقشر الصفيحة بعناية لكشف الحبل الشوكي. تمنع هذه الزاوية تلف الحبل الشوكي الأساسي. استمر في إزالة الصفيحة في الاتجاه المنقاري.

لفضح الحبل الشوكي الصدري وعنق الرحم باستخدام ملقط الأنسجة الحادة ، ارفع الحبل الشوكي برفق من العمود الفقري واقطع الجذور بمقص دقيق لتحرير الحبل الشوكي ، ضع الحبل الشوكي المستأصل في طبق بتري يحتوي على عازلة تشريح الفئران الباردة والمعقمة. اشطف المنديل بمحلول تشريح الثلج البارد واستخدم المقص لقطع الحبل الشوكي بشكل عرضي إلى أجزاء بطول سنتيمتر واحد. لكل جزء من الأنسجة ، استخدم ملقطا دقيقا لحمل الأنسجة بيد واحدة ، وباستخدام اليد الأخرى استخدم مقصا دقيقا لإزالة المادة البيضاء بعناية مع معظم المادة الرمادية ، مع ترك المنطقة المحيطة بالبطينين فقط من الحبل الشوكي.

اسحب الأنسجة المحيطة بالبطينين المقطعة إلى طبق بتري معقم بطول 10 سم يحتوي على عازلة تشريح الفئران المثلجة. لبدء عزل الخلايا الجذعية العصبية للفئران ، استخدم مقصا دقيقا لفرم كل نسيج بطيني مقطوع إلى قطع ملليمتر مكعب واحد. بعد ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتفكك الأنزيمي عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من محلول ملح إيرل المتوازن أولا إلى قارورة من غراء من مجموعة تفكك غراء.

ضع القارورة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق حتى يذوب الغراء تماما ويبدو المحلول صافيا. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن لإيرل إلى قارورة الحمض النووي من مجموعة التفكك. واخلطها برفق ، أضف 250 ميكرولترا من محلول الحمض النووي إلى القارورة التي تحتوي على غراء واخلطها برفق.

بعد ذلك ، أضف الأنسجة المفرومة حوالي 0.2 جرام في القارورة ، ثم ضع القارورة على منصة هزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى ساعة واحدة. بعد الحضانة ، قم بتصنيف الخليط بماصة سعة 10 ملليلتر لفصل أي قطع نسيجية متبقية لإنتاج معلق خلوي غائم. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق.

في درجة حرارة الغرفة أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد محلول OVO moid عن طريق خلط 2.7 مل من محلول ملح توازن إيرل مع 300 ميكرولتر من محلول مثبط الألبومين OVO MOID المعاد تكوينه. في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، أضف 150 ميكرولترا من محلول الحمض النووي المعد مسبقا إلى محلول المويد البيضاوي واخلطه عن طريق قلب الأنبوب ، وتخلص من المادة الطافية من الخلايا المحببة ، على الفور حبيبات الخلية في خليط مثبط الألبومين المخفف للحمض النووي. بعد ذلك ، قم بإعداد تدرج كثافة متقطع عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من محلول مثبط الألبومين إلى أنبوب سعة 15 مليلتر واستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر بطبقة تعليق الخلية برفق وببطء فوق محلول مثبط الألبومين.

الطرد المركزي العينة على وزن 70 جم لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد الانتهاء ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من وسط EFH للفئران الدافئ الذي تم تحضيره كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. احسب كثافة الخلايا الحية باستخدام مقياس الخلوي الدموي وقم بتقطيع الخلايا إلى قارورة ثقافة T 25 بكثافة 10 خلايا لكل ميكرولتر في EFH.

احتضان القوارير عند 37 درجة مئوية في 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والسماح للثقافات بالنمو دون إزعاج لمدة أسبوع واحد لتجنب تراكم المجالات. يظهر هنا قسم عرضي من الحبل الشوكي للفئران ملطخ باللون الأزرق السريع الفاخر ، بالإضافة إلى الهيماتين والإيوين لإظهار حدود المادة البيضاء والرمادية. يحدد المخطط المنقط الأنسجة المحيطة بالبطينين المتبقية التي تم عزلها في هذا البروتوكول من هذه المنطقة.

تنمو المجالات العصبية مثل تلك الموضحة هنا بحرية تطفو في ثقافة التعليق بتكبير عالي. يمكن رؤية المسامير الدقيقة بارزة من المجالات العصبية ، حيث تتكاثر المجالات العصبية كما هو موضح في تلوين KI 67 الإيجابي حيث تم فصل المجالات العصبية وطلاءها على آبار مغلفة ب matrigel. بالإضافة إلى ذلك ، سوف يعبرون بشكل أساسي عن العش الذي يعد علامة لخلايا السلائف العصبية.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إضافة عوامل خارجية إلى الخلايا المستنبتة لتعزيز التمايز. يمكن أيضا زرع الخلايا الجذعية العصبية البالغة أو ذريتها في نماذج حيوانية مختلفة لتقييم قدرتها على الإصلاح التجديدي. أتمنى أن تجد هذا الفيديو مفيدا ، ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.