عزل الخلايا الجذعية العصبية / السلف من المنطقة المحيطة بالبطين في الجرذان الكبار والحبل الشوكي البشري

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المحيطة بالبطين في النخاع الشوكي للجرذ البالغ أو الإنسان. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استئصال النخاع الشوكي عبر عملية استئصال الصفائح الفقرية. وتتمثل الخطوة الثانية في قطع النخاع الشوكي عرضياً إلى قطع بطول 1 cm، ثم تشريح المنطقة المحيطة بالبطين من كل قطعة من قطع النخاع الشوكي.

بعد ذلك، يتم تقطيع النسيج المفروم إلى قطع بحجم 1 mm، ثم يتم تفكيكه إنزيميًا. وتتمثل الخطوة النهائية في فصل الخلايا السليمة عن طريق الطرد المركزي عبر تدرج كثافة غير مستمر، ومن ثم زرع معلق الخلايا. وفي النهاية، يمكن تقييم تكوين الكرات العصبية ونمو الخلايا الجذعية العصبية باستخدام مجهر التألق المناعي.

سأقوم اليوم بتوضيح كيفية عزل الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة المجاورة للبطين في الحبل الشوكي للجرذ البالغ. يمكن استخدام هذه الخلايا لاحقاً للمساعدة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الخلايا الجذعية العصبية، مثل تحديد العوامل الخارجية التي تعزز التقييد السلالي أو كيفية استجابة هذه الخلايا للمحفزات أو الضغوط المختلفة. للبدء، قم بتحضير المزرعة والوسط ومحاليل التشريح المنظمة كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

بعد ذلك، وعقب إعطاء جرعة زائدة من المخدر، قم بتعقيم جلد الجرذ واستخدم مقص تشريح كبيراً لإزالة السطح الظهري، مما يكشف عن العمود الفقري. أمسك مقص التشريح بشكل عمودي ومستعرض بالنسبة للسطح الظهري، ثم اقطع العمود الفقري فوق الأطراف الخلفية.

بعد ذلك، استخدم مقصاً أصغر لقص العضلة الظهرية التي تغطي العمود الفقري طولياً في اتجاه منخاري لكشف النتوءات الشوكية بدءاً من الطرف المكشوف. أدخل أداة صغيرة غير حادة لقص العظام خارجياً في الجانب الوحشي للقناة الشوكية في المساحة الواقعة بين الحبل الشوكي والعمود الفقري. ضع الشفرة بشكل سطحي وموازٍ للحبل الشوكي.

بعد ذلك، قم بإجراء شقوق صغيرة في الصفيحة الفقرية (lamina) وقشرها بعناية للكشف عن النخاع الشوكي. تمنع هذه الزاوية حدوث تلف في النخاع الشوكي الكامن أسفلها. استمر في إزالة الصفيحة الفقرية في الاتجاه الأنفي (rostral).

لكشف النخاع الشوكي الصدري والعنقي باستخدام ملاقط الأنسجة غير الحادة، ارفع النخاع الشوكي برفق من العمود الفقري واقطع الجذور باستخدام مقصات دقيقة. ولتحرير النخاع، ضع النخاع الشوكي المستأصل في طبق بتري يحتوي على محلول منظّم لتشريح الجرذان معقم ومبرد بالثلج. اشطف النسيج بالمحلول المنظّم للتشريح المبرد بالثلج، واستخدم المقص لقطع النخاع الشوكي عرضياً إلى قطع بطول 1 cm. وبالنسبة لكل قطعة نسيجية، استخدم ملاقط دقيقة للإمساك بالنسيج بإحدى اليدين، وباليد الأخرى استخدم مقصات دقيقة لإزالة المادة البيضاء بعناية مع معظم المادة الرمادية، بحيث لا يتبقى سوى المنطقة المحيطة بالبطينات في النخاع الشوكي.

انقل النسيج المحيط بالبطينات الذي تم تشريحه إلى طبق بتري معقم بحجم 10 سنتيمتر يحتوي على محلول منظم لتشريح الجرذ بارد كالثلج. لبدء عزل الخلايا الجذعية العصبية للجرذ، استخدم مقصات دقيقة لتقطيع النسيج المحيط بالبطينات المشرح إلى قطع بحجم مليمتر مكعب واحد. بعد ذلك، قم بتحضير محلول التفكيك الإنزيمي عن طريق إضافة خمسة مليلتر من محلول إيرلز الملح المتوازن (Earl's balanced salt solution) إلى قارورة تحتوي على الباباين من مجموعة أدوات التفكيك بالباباين.

ضع القارورة عند 37 °C لمدة 10 دقائق حتى يذوب الباباين تمامًا ويصبح المحلول رائقًا. بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول إيرلز الملح المتوازن (Earl's balanced salt solution) إلى قارورة الـ DNAs المستخلصة من مجموعة التفكيك. ثم امزج بلطف، وأضف 250 µL من محلول الـ DNA إلى القارورة التي تحتوي على الباباين وامزجهما بلطف.

بعد ذلك، أضف حوالي 0.2 grams من النسيج المفروم إلى القارورة، وضع القارورة على منصة هزازة عند 37 °C لمدة تتراوح بين 45 دقيقة وساعة واحدة. بعد الحضن، قم بتفتيت الخليط باستخدام ماصة 10 mL لتفكيك أي قطع نسيجية متبقية للحصول على معلق خلوي عكر. انقل المعلق الخلوي إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 mL وقم بطرده مركزياً عند 300 Gs لمدة خمس دقائق.

عند درجة حرارة الغرفة وأثناء عملية الطرد المركزي، قم بتحضير محلول OVO moid عن طريق خلط 2.7 milliliters من محلول Earl's balance salt مع 300 microliters من محلول مثبط albumin OVO MOID المعاد تشكيله. وفي أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، أضف 150 microliters من محلول DNA المحضر مسبقاً إلى محلول oval moid واخلطهما عن طريق قلب الأنبوب، ثم تخلص من الطافي الموجود فوق الخلايا المترسبة، وأعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة فوراً في خليط مثبط albumin و DNA المخفف. بعد ذلك، قم بتحضير تدرج كثافة غير مستمر عن طريق إضافة خمسة milliliters من محلول مثبط albumin إلى أنبوب سعة 15 milliliter، وباستخدام ماصة سعة خمسة milliliters، قم بوضع معلق الخلايا بلطف وببطء في طبقة فوق محلول مثبط albumin.

قم بطرد العينة مركزياً عند 70 ×g لمدة ست دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبمجرد الانتهاء، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 1 mL من وسط EFH للجرذات المسخن مسبقاً والمُحضّر كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب. قم بتحديد كثافة الخلايا الحية باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، ثم ازرع الخلايا في قارورة زراعة T 25 بكثافة 10 خلايا لكل µL في وسط EFH.

قم بتحضين القوارير عند 37 درجة مئوية في 5% من ثاني أكسيد الكربون واترك المزارع تنمو دون إزعاج لمدة أسبوع واحد لتجنب تكتل الكريات. يظهر هنا مقطع عرضي للنخاع الشوكي للجرذ تم صبغه بـ luxal fast blue، بالإضافة إلى hematin و eoin لإظهار حدود المادة البيضاء والمادة الرمادية. يحدد الخط المنقط النسيج حول البطيني المتبقي والمشرح والذي تم عزله في هذا البروتوكول من هذه المنطقة.

ستنمو الكرات العصبية، مثل تلك الموضحة هنا، بشكل حر طافٍ في مزرعة معلقة عند تكبير عالٍ. يمكن رؤية نتوءات دقيقة تبرز من الكرات العصبية، وتتكاثر هذه الكرات العصبية كما يتضح من صبغ KI 67 الإيجابي، حيث تم تفكيك الكرات العصبية وزراعتها في آبار مطلية بـ matrigel. بالإضافة إلى ذلك، ستعبر هذه الكرات بشكل أساسي عن nestin، وهو علامة للخلايا العصبية السليفة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إضافة عوامل خارجية إلى الخلايا المستزرعة لتحفيز التمايز. كما يمكن زراعة الخلايا الجذعية العصبية البالغة أو سلالاتها في نماذج حيوانية مختلفة لتقييم قدرتها على الإصلاح التجديدي. أتمنى أن تجد هذا الفيديو مفيداً، وبالتوفيق في تجاربكم.