نظام جل متحدة المركز لدراسة دور الفيزيائية الحيوية من مصفوفة المكروية في 3D خلية الهجرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة خصائص هجرة الخلايا في بيئات ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع الخلايا أولا في هلام الكولاجين الداخلي الذي يتم إحاطته بعد ذلك بهلام كولاجين خارجي خال من الخلايا بخصائص المصفوفة المرغوبة. بعد ذلك ، يسمح للخلايا بالغزو والهجرة في الجل الخارجي الذي يمكن خلاله مراقبتها وتحليلها كميا.

في النهاية ، يتم استخدام مقايسة الهلام متحدة المركز هذه لإظهار كيفية تأثر سلوك هجرة الخلايا بالخصائص الفيزيائية الحيوية للمصفوفة خارج الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل مقايسة النقل أو مقايسة الخدش ، هي أن هجرة الخلية تحدث في بيئة معاهدة فسيولوجية ذات صلة يسهل التحكم في خصائصها الهيكلية والفيزيائية الحيوية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا ضروريا للغاية لأن تكوين نظام هلام جهاز التوجيه الداخلي المركز دقيق للغاية.

واجهة الجل المناسبة مهمة جدا لنجاح هذه التجربة ، والتي قد يكون تحقيقها صعبا بعض الشيء. ابدأ بثقافة MD MBA 2 31 خلية جاهزة للحصاد من قوارير T 25 بطلاقة 80٪. التربسين الأول هو الخلايا التي تستخدم مليلتر من المحلول لكل قارورة.

ثم اجمع الخلايا على شكل حبيبات باستخدام 200 Gs من القوة لمدة أربع دقائق ، وتخلص من snat وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الثقافة. وسائط. الآن قم بقياس كثافة الخلية باستخدام مقياس الخلوي الدموي وحدد الحجم اللازم ل 100 مليون خلية لكل مليلتر. ثم قم بتدوير الخلايا عند 200 جم لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات تماما في الحجم المطلوب من وسط الثقافة الخالية من المصل. هذا التعليق هو 10 أضعاف تركيز المقاعد النهائي. للبدء في جمع محاليل المخزون المطلوبة في دلو ثلج ، فإنها تشمل 10 XPBS ماء ميلك ، و 0.1 مولار هيدروكسيد الصوديوم.

قم أيضا بتبريد العديد من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة تحت غطاء محرك السيارة ، مع الحفاظ على تقنية معقمة ، وتناول كمية الكولاجين المطلوبة ل 50 ميكرولتر من 2.4 ملليغرام لكل مليلتر من محلول هلام داخلي. ثم أضف ببطء خمسة ميكرولترات من 10 XPBS إلى الكولاجين المقاس. قم بتدوير الأنبوب أثناء إضافة PBS ، لكن تجنب صنع الفقاعات.

بعد ذلك ، اضبط درجة الحموضة في الخليط إلى 7.4 مع المحلول الأساسي. عادة ما تقوم خمسة ميكرولتر بهذه المهمة. يتم توفير دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها في بروتوكول النص.

أخيرا ، ارفع الحجم إلى 45 ميكرولتر مع وسط ثقافة خالية من المصل مما يترك مساحة لتعليق الخلايا 10 ×. للبدء ، أضف خمسة ميكرولترات من 10 × معلق خلية إلى محلول الكولاجين وأعد تعليق الخلايا جيدا في المحلول دون تكوين فقاعات هواء. الآن إلى التسخين المسبق إلى اللوحة السفلية الزجاجية ، أضف 20 ميكرولترا من التعليق إلى المركز.

حسنا ، تشكيل قطرة على شكل قبة إذا تشكلت فقاعة ، أو تمزقها بسرعة أو امتصاصها دون إحداث فوضى. قد يكون صب الجل بالطريقة الصحيحة أمرا صعبا للغاية ، خاصة مع المحاليل اللزجة جدا مثل الكولاجين. حاول تجنب إنتاج الفقاعات قدر الإمكان ولا تقم بتدوير المحلول بمجرد أن يصبح جاهزا للبلمرة ، لأن التورم قد يؤدي إلى محاذاة الألياف الاصطناعية.

الآن أعد الطبق إلى الحاضنة لمدة 45 دقيقة للسماح للطبقة الداخلية بالبلمرة قبل 15 دقيقة من انتهاء الحضانة. تحضير 200 ميكرولتر من محلول جل الكولاجين الخارجي على الثلج. أولا ، اقتبس الحجم المطلوب من كولاجين المخزون.

ثانيا ، أضف ببطء 20 ميكرولترا من 10 XPBS مع دوامة لطيفة. ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 كما كان من قبل ، وارفع المحلول إلى 200 ميكرولتر بماء Milli Q. الآن قم بإزالة الطبق من الحاضنة وأضف برفق 180 ميكرولتر من محلول الجل الخارجي فوق قبة الجل الداخلية.

يجب أن يغطي هذا المحلول الداخلي بالكامل ويملأ البئر. لا تقلب المحلول وتجنب لمس محلول الجل الداخلي. إذا تشكلت فقاعة أثناء إخراج المحلول الخارجي، فسارع إلى تمزيقها أو امتصاصها مرة أخرى في الماصة.

خطوة أخرى مهمة هي التأكد من الحصول على واجهة هلامية مناسبة. مفتاح هذه الخطوة هو إضافة محلول الجل الخارجي. عندما يكون الجل الداخلي لم يصادق عليه بعد.

يمكن أن تختلف حركية التبلور باختلاف حالة البلمرة ومن الضروري تحسين هذه الحالة مسبقا للسماح للهلام الخارجي بالبلمرة بإعادة الطبق إلى الحاضنة لمدة 45 دقيقة. بعد 45 دقيقة ، يجب أن يكون الجل صلبا إلى حد ما ، ولكن لا يزال من الممكن إزاحته بعناية إضافة ملليلترين من الوسط الدافئ لغمر الجل بالكامل. هذا يكمل ثقافة الجل متحدة المركز التي يتم توفيرها كل يومين إلى ثلاثة أيام.

في غضون أيام ، ستبدأ الخلايا في الهجرة إلى المصفوفة الخارجية لمراقبة هجرتها ، وتلطيخ الخلايا بمتتبع الفلورسنت. استبدل ملليلترين من الوسط بوسط جديد يحتوي على خمسة ميكرولتر من الصبغة واحتضانه لمدة 30 دقيقة بعد فترة الحضانة ، واغسل المزرعة باستخدام ملليلتر واحد من PB S3 مرات لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لكل غسلة. بعد الغسيل ، أعد ملء الطبق بالوسائط العادية.

ثم ضع الطبق على مجهر يتم التحكم فيه بيئيا. استخدم الآن إعداد حجم الاستخدام لمسح مناطق الهلام الخارجية بجوار واجهة الهلام. عادة ما يتم المسح الضوئي في طرق عرض 647 ميكرون مربعة بسمك 100 ميكرون، باستخدام فواصل زمنية خمسة ميكرون على مكدس ZS.

ثم امسح المناطق الوسيطة وأخيرا امسح ضواحي الجل. استبعد المناطق الواقعة على بعد 50 ميكرون من الأسطح السفلية أو العلوية أو الجانبية لتجنب الخلايا التي قد تعاني من تأثير الحافة. لتحليل حركة الخلايا من البيانات التي تم جمعها ، افتح أولا ملفات الصور في برنامج تحليل البيانات مثل imas.

ابدأ بتحديد الأمر تجاوز ثم سطح الأوامر. يؤدي هذا إلى سحب خيار تتبع الأسطح. بمرور الوقت ، حدد منطقة الاهتمام داخل مجموعة البيانات ، مما يعني الإحداثيات الديكارتية والإطار الزمني.

بعد ذلك ، اطرح الخلفية من منطقة الاهتمام. لتجنب فقدان خلية لإزالة الخلفية، حدد أكبر كرة تتناسب مع الكائن. الآن ، قم بتقسيم الكائنات المتصلة عن طريق تحديد قطر نقطة البذور والمضي قدما في تصنيف جميع نقاط البذور.

الخطوة التالية هي تصنيف السطح الآن يدويا. تجميع النقاط الأولية التي تشير إلى نفس الكائن. افعل ذلك بين جميع النقاط الزمنية في المنطقة ذات الاهتمام.

أخيرا ، تتبع الكائنات عند اكتمال التتبع ، وتصنيف مسارات الكائنات ، ثم إخراج مجموعة البيانات الكمية لتحليلها باستخدام جدول بيانات. بعد بضعة أيام من الثقافات الهلامية متحدة المركز ، اخترقت الخلايا واجهة الهلام الخارجية الداخلية وبدأت في غزو الهلام الخارجي. تنتشر مجموعة الخلايا إلى الخارج في اتجاه شعاعي في الغالب.

تمت مقارنة حركة الخلايا في الجل الخارجي بكثافات الكولاجين المختلفة. تم إجراء التصوير على مدى ثماني ساعات ، وتم حساب حوالي 200 مسار خلية من كل عينة. تحركت الخلايا الموجودة في أنحف مصفوفة أقل مسافة.

أخذ هذا الحساب في الاعتبار جميع الخلايا ، وليس فقط الخلايا التي تهاجر شعاعيا إلى الخارج. وفي جميع الحالات، كانت المسافة الإجمالية المقطوعة أكبر من صافي الإزاحة. كما تم حساب الثبات المتوقع كنسبة بين الإزاحة والمسافة.

تشير قيمة الثبات البالغة 0.4 إلى أن هذه الخلايا لديها هجرة اتجاهية ضعيفة في جوهرها. أظهرت حسابات متوسط السرعة أن كثافة الكولاجين لم تؤثر على سرعة الخلايا. من الممكن أن يكون لحجم مسام المصفوفة وكثافة الكولاجين ، اللذين يرتبطان عكسيا ، تأثير معاكس على سرعة الهجرة وبالتالي تعويض بعضهما البعض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء نظام هلام متحد المركز وكيفية دراسة هذه الهجرة للخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد. باتباع هذا الإجراء ، يمكنك القيام بالكثير من الأشياء الأخرى مثل استخراج الخلايا ، وتحليل المصفوفات الدقيقة ، حيث يمكنك محاولة الإجابة على أسئلة إضافية مثل مقدار بروتينات معينة يتم التعبير عنها خلال نقاط زمنية مختلفة في الهجرة.