الماوس السذاجة CD4 ⁺ عزل T خلية و في المختبر التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

الهدف العام من الإجراء التالي هو استقطاب أربع خلايا تائية موجبة للقرص المضغوط الساذج معزولة من الغدد الليمفاوية للفأر ، والطحال إلى مجموعات فرعية مميزة من مساعد الت. في المختبر ، يتم تحقيق ذلك عن طريق المعالجة الأولى للطحال والغدد الليمفاوية التي يتم حصادها من الفئران البرية البالغة. في الخطوة الثانية ، يتم إثراء مجموعة الخلايا الأربعة الإيجابية CD عن طريق فصل الخرزة المغناطيسية ثم يتم فرزها بشكل أكبر من خلال تعبير علامة الخلايا التائية الساذجة.

في الخطوة الأخيرة ، تتم معالجة الخلايا بعوامل تنشيط مستقبلات الخلايا التائية واستقطاب السيتوكينات للحث على تمايزها إلى سلالات مساعدة T مختلفة. في نهاية المطاف قياس التدفق الخلوي. يتم استخدام Elis A و Real-Time PCR لتقييم كفاءة تمايز الخلايا التائية المساعدة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا التائية المساعدة ، مثل كيف يؤثر التعبير عن جزيئات معينة أو العلاج بأدوية معينة على طبيعة استجابة الخلايا التائية. ابدأ بتثبيت أطراف فأر C 57 الأسود البالغ من العمر خمسة إلى 10 أسابيع على لوحة التشريح ، ثم قم بقص الجلد طوليا من فتحة الشرج إلى الذقن ، مع الحرص على عدم ثقب الأنسجة البريتونية الأساسية. بعد ذلك ، قم بفتح الجلد واستخدم زوجا من الملقط للاستيلاء على العقدة الليمفاوية وآخر لفصل الأنسجة عن كل موقع من المواقع الموضحة في الصورة.

عندما يتم حصاد كل عقدة ليمفاوية ، ضعها في طبق تجميع يحتوي على PBS مكمل بنسبة 1٪ FBS أو PBS plus ، ثم افتح الصفاق بعناية وقم بإزالة الطحال. ضع الطحال في طبق التجميع أيضا ، وانقل الطبق إلى دلو ثلج لإثراء أربع خلايا موجبة للقرص المضغوط. قسم الغدد الليمفاوية في الطحال إلى طبقين منفصلين بحجم 60 ملم يحتويان على ثلاثة ملليلتر من PBS بالإضافة إلى كل منهما باستخدام ملقط معقم.

بعد ذلك ، ضع مربعا من شبكة النايلون المعقمة فوق الطحال واستخدم جانب الإبهام من مكبس المحقنة لتحطيمها برفق على الشبكة حتى يتم تعليق كل الأنسجة تقريبا. قم بتحريك التعليق لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت الكتل المتبقية القابلة للذوبان ثم ضع قطعة جديدة من شبكة النايلون فوق فتحة أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتصفية التعليق في الأنبوب لإزالة أي حطام متبقي.

كرر الآن التفكك الميكانيكي للغدد الليمفاوية واملأ كلا الأنبوبين من الخلايا المفلترة ب PBS plus. ثم اقلب الأنابيب عدة مرات وقم بتدوير الخلايا. أعد تعليق حبيبات العقدة الليمفاوية في ملليلترين من PBS.

أضف ملليلترا واحدا من البرد المثلج ، وهو محلول CK لكل فأر إلى حبيبات خلية الطحال. بعد دقيقة واحدة ، أوقف تحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام 10 ملليلتر من PBS plus. اقلب الأنبوب وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى.

ثم أعد تعليق حبيبات الطحال في 10 ملليلتر إضافي من PBS plus ، أضف خلايا العقدة الليمفاوية وقم بتدوير معلق الخلية المجمع. هذه المرة ، قم بتعليق الحبيبات في 15 ميكرولتر من القرص المضغوط ، وأربعة حبات مغناطيسية مخففة في 85 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى كل فأر لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم قم بتخفيف الخلايا في 10 ملليلتر من PBS plus.

قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة من النايلون في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر وقم بتدوير الخلايا. مرة أخرى ، أعد تدوير الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS زائد لكل فأرة وحدد بشكل إيجابي للقرص المضغوط أربع خلايا موجبة عن طريق اختيار الخرزة المغناطيسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد الحصول على جزء الخلية الإيجابي الأربعة الموجب للقرص المضغوط ، اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من PBS زائد لفرز جزء الخلايا التائية الأربعة موجبة للقرص المضغوط

بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الفلورية المناسبة لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام بعد الغسيل. قم بتصفية الخلايا المصنفة لإزالة أي حطام ونقلها إلى أنبوب فاكس على الجليد وحمايته من الضوء ، فرز القرص المضغوط أربعة موجب ، CD 25 سالب CD 62 L ، CD الموجب 44 سكانا سلبيا في وسط RPMI كامل. عندما يتم جمع جميع الخلايا.

اغسل الخلايا التائية الساذجة في وسط جديد وكامل. ثم قم بإعادة تعليق الحبيبات وقم بإكمال RPMI ، وقم بحساب الخلايا التائية الساذجة واضبط التركيز على واحد في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر للحث على تمايز المجموعة الفرعية المساعدة في المختبر. بعد ذلك ، اغسل كل بئر من ألواح زراعة الخلايا المطلية مسبقا بمضاد للقرص المضغوط ثلاثة ومضاد للقرص المضغوط 28 في مليلتر واحد من PBS المعقم وخالي من FBS والصفيحة.

تكمل الخلايا أخيرا وسط الثقافة بالسيتوكينات المناسبة والأجسام المضادة المانعة كما هو موضح في الجدول وتحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة إلى خمسة أيام بعد أربعة إلى خمسة أيام في المزرعة. يمكن إجراء تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا للقرص المضغوط أربع خلايا تائية موجبة من TH واحد متمايز في المختبر ، يمكن إجراء اثنين من ثقافات Treg المحفزة و TH 17. للتأكد من أن كل مجموعة فرعية من الخلايا التائية تعرض ملف تعريف السيتوكين المتوقع.

في الواقع ، بعد إعادة التحفيز لمدة 24 ساعة باستخدام ثلاثة EISs المضادة للقرص المضغوط ، يظهر A أن المجموعات الفرعية تظهر الإنتاج خارج الخلية المقابل لبروتينات السيتوكين المعبر عنها داخل الخلايا أيضا. يتحقق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لعوامل النسخ الخاصة بالنسب من ملفات تعريف عامل النسخ المناسبة للقرص المضغوط المتمايز في المختبر لأربع مجموعات فرعية إيجابية للخلايا التائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل ومعالجة خلايا العقدة الليمفاوية والطحال المتطابقة للحصول على أربع خلايا مساعدة تائية إيجابية للقرص المضغوط الساذج.

علاوة على ذلك ، ستتمكن من تمييز هذه الخلايا التائية إلى خلايا TH واحدة أو TH اثنين TH 17 أو خلايا ireg.