Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من انواع معينة ايليجانس

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تطور السلوك والنشاط العصبي للعديد من كبار السن. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الديدان في غرف الموائع الدقيقة المملوءة بالطعام. يتم إجراء تصوير الكالسيوم طويل المدى باستخدام كاميرا E-M-C-C-D ويؤدي TTL إلى أوقات تعريض قصيرة للعرض.

يمكن توسيع نطاق الإجراء عن طريق مسح غرف متعددة بالتتابع أو عن طريق تصوير عدة غرف في وقت واحد. تظهر النتائج سلوك اليرقات والبالغين بالإضافة إلى الكالسيوم العابر للقيادة بين الخلايا العصبية. الميزة الرئيسية لتقنية الغرفة الصغيرة هذه هي أنه يمكن متابعة السلوك والتطور على مدى فترة طويلة من خلال التصوير عالي الجودة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم ملء الغرف الصغيرة بالكمية المناسبة من الطعام والدفء. للبدء في إعداد مجهر مع سخان الغطاء والمرحلة الأوتوماتيكية ونظام كاميرا E-M-C-C-D. تصنيع طوابع بولي ميثيل سوبوكسان في منشأة الموائع الدقيقة أو باستخدام مسبك تجاري.

قم بتقطيع شريحة PDMS إلى 16 طابعا فرديا باستخدام مشرط. بعد ذلك ، قم بتعريض كل من الختم والشريحة الزجاجية لبلازما الهواء لمدة دقيقة واحدة تقريبا قبل إرفاق الختم بالشريحة. العمل ببطء لتجنب ذوبان البلاستيك.

اقطع مساحة مربعة من قاع طبق 3.5 سم. تحضير عدة أطباق في وقت واحد. قم بإعداد كميات معقمة لكل من نقطة الانصهار العالية والمنخفضة قبل الاستخدام.

ضع ثلاث حصص من نقاط الانصهار العالية على كتلة تسخين. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإذابة eloqua واحد من نقطة الانصهار المنخفضة قبل نقله إلى كتلة تسخين منفصلة. أولا ، خذ الطبق البلاستيكي مع الفتحة المربعة التي تم إنشاؤها مسبقا وضعها رأسا على عقب بحيث تكون الفتحة متجهة لأعلى.

استخدم قطعة من الشريط اللاصق على الوجهين لتغطية الفتحة. اقلب الطبق بحيث يكون الشريط اللاصق في الأسفل وضع الطبق على سطح صلب. قطع الفتحة مجانا باستخدام مشرط.

بعد ذلك ، املأ المنطقة المحيطة بالفتحة بملليلترين من نقطة الانصهار العالية. انتظر حتى يصبح agros صلبا. بمجرد التصلب ، قم بإزالة الفيلم الواقي الذي يغطي الشريط اللاصق على الوجهين على الجانب الآخر.

ينتج عن هذا حلقة رفيعة من الشريط اللاصق الذي يحيط بالجزء الخارجي من الفتحة. يعمل الزرع كخزان رطوبة يحيط بالعينة لاحقا. قبل إنشاء الغرف الدقيقة ، قم بإعداد سطح ختم PDMS عن طريق تعريضه لبلازما الهواء لمدة 20 إلى 60 ثانية.

قم بإنشاء فواصل متساوية الارتفاع عن طريق تكديس خمس إلى تسع شرائح زجاجية. ضع شريحة زجاجية واحدة بين مكدسين المفاصلين. بعد ذلك ، ضع الشريحة الزجاجية التي تحتوي على ختم PDMS عبر الفواصل.

اضبط ارتفاع الفواصل بحيث يكون هناك مسافة 1.5 ملم بين سطح التشكيل والشريحة الزجاجية. عندما تكون جاهزا ، ضع قطرة من نقطة الانصهار العالية الساخنة على الشريحة بالقرب من ختم PDMS وحرك الختم بسرعة أفقيا في السائل aros. بمجرد أن يتجمد القوس ويبدو معتما ، اسحب الختم عموديا بحركة واحدة.

باستخدام معول سلك بلاتيني ناعم ، انقل البيض أو الديدان مع بكتيريا OP 50 إلى الحبوب. استخدم رمشا لتوزيع بيضة واحدة أو دودة واحدة لكل غرفة مع الطعام. يجب أن تحتوي وسادة aros واحدة على حوالي 30 دودة.

قم بتقطيع لوح aros الذي يحتوي على الغرف الصغيرة إلى مربع بحيث يتناسب بشكل جيد مع فتحة الطبق. استخدم الملقط لرفع البلاطة ووضعها رأسا على عقب على زلة غطاء زجاجي بمجرد سقوطها ، لا ترفع أو تنزلق زلة الغطاء. لتجنب دفع المحتويات خارج غرفهم.

الغرف مختومة الآن. بعد ذلك ، ضع زلة الغطاء في فتحة الطبق البلاستيكي. اضغط برفق على الغطاء ، وانزلق لأسفل على الحلقة المصنوعة من شريط لاصق على الوجهين.

احرص على عدم كسر الزجاج. اقلب الطبق رأسا على عقب واستخدم نقطة انصهار منخفضة لملء الفجوة بين لوح الزراعة وخزان الأروس عندما يصلب الأروس. أغلق الطبق بغطاء وبارام.

بعد الانتهاء من إعداد الغرف الصغيرة ، افحصها تحت مجهر ستيريو بشكل صحيح. يعد ملء الغرف والتحكم في الرطوبة أمرا بالغ الأهمية للنجاح. للبدء ، ضع الطبق الذي يحتوي على الغرف الدقيقة على المجهر وركز على العينة ، سجل 40 إطارا للصور في 20 ثانية كل نصف ساعة لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، قم بإعداد الفحص بحيث يزور كل دودة باستخدام المرحلة. تهدف إلى تصوير حوالي 30 دودة في شوط واحد. يمكن تصوير ديدان متعددة عن طريق التصغير.

استخدم تكبيرا أقل لتغطية العديد من الغرف الصغيرة وتصوير العديد من الغرف الصغيرة المجاورة في وقت واحد. بعد انتهاء الحصول على الصورة ، افصل البيانات لكل غرفة على حدة عن طريق اقتصاص منطقة اهتمام تغطي واحدا. يمكن استخدام الإطار والطرح لتقييم بيانات التنقل بسرعة.

بعد التصوير ، يتم إجراء تصوير الكالسيوم على مجهر مركب مجهز لمضان epi واسع المجال. للحد من التعرض للضوء، استخدم إشارة منطقية للترانزستور تقوم بتشغيل مؤشر LED لإضاءة العينة. في الوقت نفسه ، تسجل الكاميرا إطارا.

قم بتشغيل فيلم متتابع لمدة 24 ساعة. يصور كل دودة كل 15 إلى 30 دقيقة. أول سجل 20 ثانية مع DIC.

ثم 20 ثانية مع مضان GFP. وأخيرا ، صورة لإشارة MK اثنين لمستويات التعبير التحكم. لفحص البيانات المرئية ، استخدم خريطة ألوان خاطئة لتحسين رؤية التغييرات الصغيرة في شدة التألق.

أخيرا ، قم بإجراء تحليل بيانات الكالسيوم باستخدام الإجراءات القياسية. يوضح هذا المثال سلوك اليرقات. تسمح الغرفة ذات الأبعاد الأكبر بالتطور من بويضة إلى شخص بالغ على المدى الطويل ، ويتم عرض التغييرات في السلوك هنا.

بذور يرقة المهر هنا هي مرحلة حياة بديلة يتم تشغيلها أثناء الظروف البيئية المعاكسة. وضعت هذه الدودة البالغة العديد من البيض في الغرفة. أخيرا ، تظهر هذه الصورة خنثى بالغا وذكرا يتزاوجان داخل غرفة بالغة.

يظهر هنا تصوير الكالسيوم للقيادة بين الخلايا العصبية A VA ليرقة L واحدة. تظهر هذه الصور نشاط الكالسيوم لنفس النوع من الخلايا العصبية في بالغ. يسمح توسيع نطاق التصوير طويل المدى بتصوير 30 دودة على شريحة كاميرا واحدة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم ملء الغرف بالكمية الصحيحة من الطعام وضمان الحركات الصحيحة للأجارو. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تصوير غرفة آروس الدقيقة في مراحل الحياة المختلفة لأناقة البحر.