الكشف عن الأمراض المرتبطة α-synuclein التي كتبها المحسن ELISA في دماغ الفئران المعدلة وراثيا Overexpressing A53T الإنسان تحور α-synuclein

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تراكم بروتين ألفا سينوكلينات المرتبط بالمرض في نموذج فأري معدل وراثي لمرض باركنسون باستخدام نهج إليزا كمي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق السماح للفئران غير الملقحة بالتقدم في العمر بشكل طبيعي أو عن طريق حقن الفئران داخل المخ بمستخرج دماغي من الفئران المريضة M 83. بعد أن تتطور الفئران إلى مرض إكلينيكي وتتم قتلها، يتم تشريح مناطق الدماغ من الفئران.

التالي يتم تحضير متجانسات من كل منطقة من مناطق الدماغ في سائل عالى الملح، ويتم إجراء إليزا على المتجانسات من أجل تحديد كمية بروتين ألفا سينوكلينات المرتبط بالمرض في كل منطقة من مناطق الدماغ. تظهر نتائج إليزا أن الشكل المرتبط بالمرض من بروتين ألفا سينوكلينات يتركز بشكل رئيسي في مناطق الدماغ المتوسطة، بما في ذلك الدماغ المتوسط وجذع الدماغ، وكذلك في الحبل الشوكي للفئران. الميزة الرئيسية لهذه التقنية إليزا مقارنة بالطرق المتاحة مسبقًا مثل Western Blot أو المناعية الخلوية، هي أنها توفر قياسًا سريعًا وموثوقًا للبروتينات المرتبطة بالمرض.

في هذا النموذج التجريبي، يمكن أن يساعد هذا الأسلوب في مراقبة تراكم وانتشار هذا البروتين في الجهاز العصبي المركزي لهذه الفئران الم 83. يشير ذلك إلى مشاركة آلية تشبه الدماغ حتى تطور العلوم السريرية. يمكن النظر في التطورات الإضافية لهذا الأسلوب في المستقبل لدراسة العديد من العينات البيولوجية مثل السائل الدماغي الشوكي أو الدم التي قد تحتوي أيضًا على أشكال ألفا المتغيرة التي توضح أن هذه الإجراء سيقوم بها فني من مختبراتنا.

كانت جميع الإجراءات والبروتوكولات التي تشمل الحيوانات متوافقة مع توجيهات اللجنة الأوروبية 86 6 0 9 EEC، وصادق عليها اللجنة الأخلاقية الفرنسية، اللجنة الوطنية الفرنسية لأخلاقيات البحوث وتجارب الحيوانات، حيث تم إيواء الحيوانات والعناية بها في مرافق تجريبية معتمدة في ليون يونغ بعد قتل الفئران واستخراج أدمغتهم والحبل الشوكي. وفقًا للبروتوكول النصي، ضع دماغًا كاملاً في طبق بيتري على الثلج تحت تكبير منخفض.

ابدأ بفصل إحدى البصلتين الشميتين عن طريق وضع الملقط خلف البصلة. باستخدام حركة هبوطية، افصلها عن الدماغ، ثم أزل البصلة الثانية بطريقة مماثلة. الآن أثناء استخدام الملقط للحفاظ على الدماغ في مكانه، قم بإدخال زوج ثانٍ من الملقط بلطف بين القشرتين اليمنى واليسرى وحركهم إلى الأمام لفصل النصفين.

الآن استمر في تثبيت الدماغ في مكانه. قم بوضع الملقط الثاني، على بعد ميلمترين خلف القشرة، وحافظ على الضغط للأعلى لرفع القشرة عن الحُصين. ثم قم بإزالة الجزء الأول من القشرة عن طريق البدء من الحصين والتحرك نحو الجزء الأمامي من الدماغ.

كرر مع النصف الثاني. ثم قم بوضع الملقط حول أحد الحُصين. ثم قم بإغلاق الملقط بلطف في أسفل العضو وإزالته بلطف.

كرر مع الحصين الثاني. قم بوضع الملقط خلف أحد السُلط والفصل بلطف عن الدماغ. استخدم الملقط لإزالة أي قشر متبقية من السُلط قبل إزالة الساتو الثاني لفصل المخيخ عن باقي الدماغ بالملقط، قم بخفض محيط المخيخ بلطف.

ثم قم بوضع الملقط خلف المخيخ وحرك الملقط للأمام لإزالته باستخدام الجزء العريض من الملقط، رفعهم كمخيخ، وهو مؤلف من أربعة هياكل دائرية لرؤية مكان انضمام جذع الدماغ بوضوح. ثم قم بعمل شق عمودي عند النقطة المتصلة قبل إزالة جذع الدماغ، قم بوضع الملقط خلف الدماغ المتوسط وقم بإمالته عموديًا لفصله تمامًا عن بقية الدماغ. لتحضير متجانسات الدماغ، أضف حجمًا كافيًا من سائل HS العالى الملح إلى مناطق الدماغ المقطعة للوصول إلى النسبة المتوقعة من المتجانسات كما هو موضح في الجدول أدناه.

باستخدام مطحنة الأنسجة المكونة من أنبوب زجاجي من البورسليكات ومكابس الأنبوب A و B، قم بصب منطقة الدماغ المراد سحقها في الأنبوب. ثم قم بتفتيت الأنسجة 10 مرات باستخدام مكبس أ لفصلها. ثم قم بالتبديل إلى مكبس ب وقم بتفتيت 20 مرة إضافية.

باستخدام ماصة نقل، قم بنقل المتجانسات إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، وكرر عملية التفجير مع عينات الدماغ المتبقية. قم بفصل العينات عند 1000 G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم قم بجمع السوائل وقسمها إلى 200 ميكرولتر علي وات. قم بتخزينها في درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية للتحليل اللاحق باستخدام إليزا على متجانسات الدماغ.

ابدأ باستخدام 50 ميكرومولار من سائل كربونات لتخفيف مضاد ألفا سينوكلينات، جسم مضاد تعددي الأرنب أو جسم مضاد أحادي النسيلة مستنسخ 42 إلى 0.01 نانوجرام لكل ملليلتر مع 100 ميكرولتر من محلول طلائه المضاد، قم بتغطية آبار لوحة ميكرو 96 وقم بحضانتها عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي، قم بإضافة 300 ميكرولتر من PBST إلى الآبار واستخدم غسالة لوحات لغسل الألواح خمس مرات أثناء العمل في درجة حرارة الغرفة.

بالانتقال إلى الأمام، قم بإضافة 200 ميكرولتر من سائل سداسي التكافؤ PBS إلى كل بئر، وقم بهز الألواح عند 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة قبل استخدام PBST لغسل الألواح خمس مرات باستخدام PBST 1%BSA قم بتخفيف متجانسات الدماغ وفقًا للإرشادات المدرجة هنا وأضف 100 ميكرولتر إلى كل بئر. ثم قم بحضانتها في درجة حرارة الغرفة و 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين قبل استخدام PBST لغسل الألواح. بعد الغسل النهائي، قم بإضافة الأجسام المضادة اللازمة لكشف ألفا سينوكلينات المخففة في PBS BST و 1%BSA كما هو موضح في الجدول 2 من البروتوكول النصي، وقم بحضانتها في درجة حرارة الغرفة و 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة قبل غسل الألواح خمس مرات كما هو الحال من قبل.

التالي قم بإضافة إما الأجسام المضادة للفأر أو مضاد IgG HRP للأرانب المخففة إلى واحد إلى 8000 في PBST 1%BSA، وحضنها عند 150 دورة في الدقيقة لمدة ساعة قبل غسل الألواح خمس مرات. ثم قم بإضافة 100 ميكرولتر من محلول TMB إلى كل بئر، وحضنه عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في الظلام. قم بإيقاف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك العادي لكل بئر.

ثم استخدم قارئ الألواح لقياس الامتصاصية عند 450 نانومتر لتحليل البيانات. اطرح قيمة الكثافة البصرية التي تم الحصول عليها في البئر الفارغ الذي يحتوي فقط على السوائل والكواشف من الكثافة البصرية.

تتم إجراء التحليل الإحصائي للقيم المحددة من عينات الدماغ وفقًا للبروتوكول النصي في هذه الدراسة، تم إجراء إليزا بشكل خاص لتحديد ألفا سينوكلينات المرتبط بالمرض pser 1 29 في متجانسات الدماغ من الفئران المسنة المريضة M 83. لم يتم ملاحظة ذلك في الفئران المسنة M 83. أظهرت الأجسام المضادة الإضافية التي تم اختبارها مثل LB 5 0 9 إشارات قوية في الفئران المريضة ولكن ليس في الفئران الصحية.

تم مقارنة الحساسية التحليلية لإليزا الموضحة في هذا الفيديو بطريقة Western Blot الموصوفة مسبقًا. كان ما يقرب من 10 ميكروجرام من معادلات الدماغ كافيًا لإنتاج إشارة إليزا إيجابية لـ p 1 29 ألفا سينوكلينات من فأر مريض. ومع ذلك