استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام TED-on وظيفي في أسماك الزيبرفيش لتحقيق تعبير جيني مشروط وخاص بأنسجة معينة، كما هو موضح في زعنفة الذيل المتجددة في هذا الفيديو. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توليد سلالات متحولة جينياً من منشطات Tet تعبر عن منشط نسخ قابل للتحفيز بالتتراسيكلين وموسوم بـ am cyan في النسيج المستهدف، وسلالات مستجيبة لـ Tet تحتوي على جين اهتمام موسوم بـ ype تحت تحكم عناصر مستجيبة لـ Tet. بعد ذلك، يتم إنشاء تركيبات محددة من أسماك متحولة جينياً مزدوجة من منشط Tet والمستجيب لـ Tet.

بعد ذلك، يتم تحفيز تعبير الجين الناقل المستجيب لـ Tet والخاص بأنسجة معينة من خلال إعطاء doxycycline. وأخيراً، يتم التحقق من تعبير الجين الناقل المستجيب لـ Tet عن طريق تحضير قطاعات نسيجية هنا من الزعانف المتجددة. وفي النهاية، يُستخدم التألق المناعي لتصوير تعبير الجين الناقل المستجيب لـ Tet والخاص بأنسجة معينة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل التعبير الجيني المستحث بالصدمة الحرارية، في أن هذا النظام يسمح بتعبير جيني مستحث وقابل للعكس بطريقة متخصصة في أنسجة معينة. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في اكتساب فهم أكثر عمقاً لشبكات الإشارات الجزيئية التي توجه تجديد زعانف الأسماك، حيث تتيح تحليل مسارات الإشارات ووظيفة الجينات في أنسجة فردية. وبينما نستخدم هذه التقنية لدراسة تجديد زعانف zebrafish، يمكن أن تكون مفيدة أيضاً في العديد من السياقات الأخرى التي تتطلب تلاعباً متخصصاً في الأنسجة لوظيفة الجينات.

بعد توليد خطوط أسماك مستجيبة للـ Tet وفقاً للبروتوكول النصي، يتم تقييم التكامل في الخط الجرثومي وقابلية تحريض الجين المنقول عن طريق تزويج أسماك G zero فردية مع خط منشط Tet تم إنشاؤه مسبقاً. ثم يتم جمع الأجنة وتربيتها حتى تصل إلى مرحلة يمكن فيها تقييم تحريض المستجيب لـ Tet. قم بتحضير محلول مخزون من doxycycline بتركيز 2000x باستخدام 50% ethanol لإذابة doxycycline للوصول إلى تركيز 50 mg/mL.

تُخزّن الأجزاء الموزعة من docks محمية من الضوء عند درجة حرارة -20 °C. بعد ذلك، يتم تحضير وسط أجنة E3 يحتوي على docks بتركيز نهائي قدره 25 µg/mL. ثم يتم سكب معظم وسط E3 بعيداً عن الأجنة.

استبدله بوسط E3، ثم أعد الأجنة إلى درجة حرارة 28.5 °C لمدة لا تقل عن ست ساعات. وبعد انتهاء فترة الحضانة، استخدم مجهراً ستيريو فلوروسنت لفحص الأجنة بحثاً عن تألق Y pet. قم بتأسيس عدة سلالات مستقرة من مستجيب Tet المعدلة وراثياً من المؤسسين الذين تم تحديدهم للتو.

اختر السلالات التي تحفز التعبير بقوة وتظهر درجة منخفضة من الفسيفسائية ضمن نطاق التعبير المتوقع، بالإضافة إلى تباين ضئيل بين الأجنة الفردية. وبمجرد إنشاء سلالات أسماك TED المنشطة وسلالات Tet المستجيبة، قم بتزويج حاملات منشط Tet مع حاملات مستجيبة لـ Tet لإنتاج أسماك مزدوجة التعديل الجيني. يتم اختيار الأجنة التي تحمل الجين المنشط لـ Tet من خلال الفحص للكشف عن فلورة am cyan باستخدام مجهر ستيريو، ثم تُربى الأجنة الموجبة لـ am cyan حتى تصل إلى مرحلة البلوغ.

حدد الأسماك البالغة مزدوجة التحول الجيني التي تحمل مستجيب Tet بالإضافة إلى منشط Tet عن طريق التنميط الجيني القائم على PCR أو من خلال قدرتها على تحفيز تعبير مستجيب Tet في النسيج المستهدف لإجراء تلوين الزعنفة الذيلية. قم بتخدير أسماك الزبرا البالغة في بيكر مليء بمياه الأسماك التي تحتوي على 160 micrograms per milliliter من التريكاين. عندما تتوقف السمكة عن الحركة، استخدم الملقط لنقلها بعناية إلى طبق بتري مقلوب واستخدم المشرط لإجراء بتر جزئي للزعنفة الذيلية لمعالجتها بـ docs. قم بتجهيز صناديق التربية بلتر واحد من مياه نظام الأسماك التي تحتوي على 25 micrograms per milliliter من doxycycline.

كضابط سلبي، أضف 250 microliters من الإيثانول بدلاً من doxycycline إلى صناديق التزاوج التي تحتوي على لتر واحد من مياه نظام الأسماك، وانقل ما يصل إلى 10 أسماك مزدوجة التحول الجيني إلى كل صندوق تزاوج، وضع الصناديق في الظلام لتقليل الإجهاد. بعد ست ساعات كحد أدنى، قم بتخدير الأسماك المعالجة ونقلها إلى طبق مغطى بـ aros رطب، واستخدم الملاقط لبسط الذيل. أخيراً، وتحت مجهر فلوري، افحص الأسماك للبحث عن ظهور Y PET داخل الأنسجة المتجددة.

بعد ذلك، يمكن استخدام الأسماك لإجراء علاجات إضافية أو إعادتها إلى نظام إيواء الأسماك لإنهاء تحفيز الجين المنقول المستجيب (responder transgene) عقب عملية البتر الجزئي للزعنفة والعلاج بـ docs. أعد بتر الزعانف المتجددة عند حوالي أربعة إلى خمسة قطع عظمية قريبة من مستوى البتر الأولي وفي نقطة زمنية تعتمد على إعداداتك التجريبية كما تم وصفه سابقاً في هذا الفيديو. وباستخدام الملاقط ومع الإمساك بجزء الجذع من النسيج فقط، ضع الأنسجة المتجددة بعناية بشكل مسطح في طبق بتري صغير يحتوي على 4% weight per volume من PFA في PBS، وثبّتها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي، استخدم PBS لغسل الأنسجة المتجددة مرتين قبل نقلها إلى 0.5 molar E-D-T-A-P-B-S لإزالة تكلس المصفوفة العظمية عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد ذلك، قم بتحضين الأنسجة المتجددة في سلسلة من السكروز PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة لكل مرحلة، وأخيراً في أجزاء متساوية من 30% sucrose PBS ووسط تجميد الأنسجة لمدة 30 دقيقة إضافية.

انقل الزعانف إلى وسط تجميد الأنسجة واتركها في الحاضنة عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين على الأقل. بعد ذلك، ضع قوالب التجميد (cryo molds) على شريحة مجهرية واملأها بوسط تجميد الأنسجة. انقل الأنسجة المتجددة إلى قوالب التجميد ووجه النسيج للحصول على مقاطع طولية أو عرضية.

تأكد من أن الجزء المتجدد مستقيم لتسهيل عملية التقطيع. انقل قوالب التجميد مع الشريحة المجهرية إلى حامل معدني موضوع على طبقة من الثلج الجاف لبدء عملية التجميد. وعندما يتصلب الوسط، انقل قوالب التجميد مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة للسماح للوسط بالذوبان عند الواجهة البلاستيكية للوسط.

ثم باستخدام أداة مثل القلم، ادفع الكتلة المجمدة خارج قالب التجميد (cryo mold) وخزنها في درجة حرارة -80 °C حتى يتم تقطيعها باستخدام الميكروتوم المجمد (cryo microtome). اجمع مقاطع بسمك 10 to 14 µm على شرائح مجهرية لاصقة وخزن الشرائح في درجة حرارة -20 °C حتى وقت الحاجة إليها. ولتوصيف تعبير مستجيب Tet في مقاطع الزعنفة، عالج المقاطع بـ 100% MEOH المبرد إلى درجة حرارة -20 °C لمدة 30 دقيقة.

قم بإزالة السائل بعناية باستخدام منديل ورقي. ثم اغسل المقاطع مرتين باستخدام PBT ومرة واحدة باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بتحضين المقاطع لمدة 10 دقائق في dappy قبل استخدام PBS للغسل مرتين لمدة 10 دقائق لكل مرة.

ثم استخدم عامل تثبيت Antifa وشريحة غطاء لتثبيت العينات قبل استخدام المجهر الفلوري متحد البؤر أو واسع المجال لتصوير العينات بعد إنشاء نظام TET وظيفي في سمك الزيبرفيش. يمكن استخدام هذا النظام لاختبار وظيفة الجين أو مسار التأشير في أنسجة فردية. وكما هو موضح هنا، فإن منشط tet الذي يقوده محفز HER 4.3 يحفز تعبير TED المستجيب فقط في مجموعة فرعية من أنسجة الجزء المتجدد؛ حيث يتم اكتشاف فلورة YFP في الخلايا القاعدية القريبة التكاثرية، بينما تخلو الخلايا القاعدية البعيدة والبشرة من التعبير.

إن تعبير مضاد WNT beta-Catenin المعروف باسم axin 1 في النطاق HER 4.3 الذي يحتوي على الخلايا التكاثرية في البلاستيما، لا يؤثر بشكل مفاجئ على تكاثر الخلايا التجددية. يشير هذا إلى أن إشارات WNT beta-Catenin في البلاستيما القريبة التكاثرية ليس لها دور أساسي في تنظيم تكاثر خلايا البلاستيما. في المقابل، فإن استخدام خط منشط Tet الذي يقوده محفز اليوبيكويتين لتحفيز تعبير axin 1 في جميع أنسجة الزعنفة المتجددة يتداخل بقوة مع تكاثر الخلايا التجددية.

بالإضافة إلى ذلك، فإن التعبير عن axon one في نطاق HER 4.3، الذي لا يشمل الخلايا البانية للعظم، يتداخل بقوة مع تكوين العظام في النسيج المتجدد. وبناءً على ذلك، فإن التداخل النوعي النسيجي مع إشارات wind باستخدام نظام TE on يكشف عن وظائف غير مباشرة وغير متوقعة لإشارات wind في تنظيم تكاثر الخلايا وتجديد العظام. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها للتعبير الجيني المستحث والمستهدف في أي نسيج مراد دراسته.

لقد طبقنا هذه الطريقة بنجاح لاستقصاء الوظائف المحددة للأنسجة لإشارات النيكوتين في سرير الرياح في الزعنفة الذيلية المتجددة لسمكة S. وسيساعد استخدام هذه الطريقة في اكتساب فهم أكثر شمولاً للمحددات الجزيئية التي تنظم تجدد الأنسجة.