التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

الهدف العام من التجربة التالية هو تخليق وتوصيف جسيمات نانوية للقاحات قائمة على الدهون، وتقييم قدرتها على تحفيز توسع الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا والمتخصصة بالمستضد في الجسم الحي. ويتم تحقيق ذلك من خلال هندسة حويصلات متعددة الطبقات متشابكة ومترابطة بين الطبقات تحاكي المسببات المرضية، أو ما يعرف بـ I CMVs، محملة بشكل مشترك بالمستضد والمادة المساعدة لتطعيم الفئران السليمة. يتم ذلك عن طريق النقل التبني لـ CD eight positive T cells متخصصة بالمستضد وتعبر عن لوسيفيراز.

في الخطوة الثانية، يتم تقييم تمدد الخلايا التائية CD eight positive النوعية للمستضد عن طريق التصوير الحي للجسم الحي بالكامل. ثم تُصبغ الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي التي تم جمعها من الحيوانات المحصنة بـ ICMV باستخدام رباعيات (tetramers) موسومة بفلوريسنت، وتُحلل بواسطة قياس التدفق الخلوي لتحديد تكرار الخلايا التائية CD eight positive النوعية للمستضد داخلياً ضمن الحيز الجهازي. وفي النهاية، يمكن استخدام التصوير بالتلألؤ البيولوجي لتتبع تمدد الخلايا التائية السامة للخلايا النوعية للمستضد استجابةً للتطعيم بالجسيمات النانوية.

يمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة تمهيدية رئيسية في تصميم اللقاحات، مثل ما هو مدى توسع الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا وكيف تنتقل هذه الخلايا إلى الأنسجة المختلفة استجابةً للتطعيم بالجسيمات النانوية؟ وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية، مثل تحليل الخلايا التائية في الموقع بعد تشريح الأنسجة، في أن التصوير الحي لاستجابة الخلايا التائية غير بضعي، مما يسمح بالمراقبة الطولية للحيوان نفسه. ابدأ بخلط DOPC وMPB بنسبة مولية واحد إلى واحد في الكلوروفورم، مع الحفاظ على كمية إجمالية من الدهون تبلغ 1.26 micromoles لكل دفعة في وعاء زجاجي سعة 20 milliliter.

بعد ذلك، أضف الحمولة المحبة للدهون إلى المحلول الدهني بالتركيز المطلوب، وقم بتطهير المحلول بغاز النيتروجين شديد الجفاف لإزالة المذيب العضوي تماماً. ضع العينة تحت التفريغ طوال الليل، وفي صباح اليوم التالي، أضف 200 µL من BTP بتركيز 10 mM يحتوي على الحمولة القابلة للذوبان في الماء المراد دراستها لترطيب الغشاء الدهني، ثم قم برج المحلول الناتج باستخدام جهاز الـ vortex لمدة 10 ثوانٍ كل 10 دقائق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.

ضع الأنبوب بعد ذلك في حمام مائي مثلج مع استمرار عملية السونيكيشن (sonication) باستخدام إعداد شدة 40% على مسبار بتردد 20 kilohertz وقدرة 125 watt. وبعد خمس دقائق، أضف 4 µL من DTT بتركيز 150 millimolar إلى الأنبوب، ثم استخدم جهاز الفورتكس (vortex) للمزج، وقم بتدوير العينة في جهاز طرد مركزي دقيق لترسيبها. بعد ذلك، اخلط 40 µL من كلوريد الكالسيوم بتركيز 200 millimolar مع العينة، ثم قم بعملية الربط التقاطعي (cross-linking) لطبقات الدهون المحتوية على MPB مع DTT عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة.

في نهاية فترة الحضن، يتم تدوير المحلول ثلاث مرات، مع إضافة 200 µL من الماء المقطر مرتين خلال دورتي الطرد المركزي الثانية والثالثة لإزالة كلوريد الكالسيوم المتبقي، و DTT غير المتفاعل، والمواد المشحونة غير المغلفة من الطافي. وبعد عملية الطرد المركزي الأخيرة، نقوم بتعليق I CMVs في 100 µL من pegol المحضر حديثاً لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. ثم تُغسل الحويصلات مرتين إضافيتين بالماء المقطر مرتين.

أعد تعليق الراسب النهائي في PBS وخزّن ICM VS عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. ولتوصيف الجسيمات، اخلط معلق ICMV البارد قبل تخفيف كمية صغيرة من العينة في حجم إجمالي قدره 1 مل من الماء المقطر مرتين. ثم ضع I CMVs في خلية zeta sizer واستخدم نظام قياس تشتت الضوء الديناميكي وجهد زيتا لقياس حجم الجسيمات ومؤشر تشتت الحجم وجهد زيتا للعينات وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

لعزل الخلايا التائية الموجبة لـ CD8 والمعبرة عن لوسيفيريز والمحددة لـ ova. أولاً، يتم حصاد الطحال من الفئران المعدلة وراثياً لـ OT one لوسيفيريز. توضع الأنسجة في 5 mL من محلول PBS البارد والـ FBS بتركيز 2%، ثم تُنقل إلى غطاء استنبات الأنسجة.

استخدم مكبس سرنجة سعة 3 مل لسحق ما يصل إلى ثلاثة طحال في وقت واحد عبر مصفاة بمسام 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل المكبس والمصفاة بمحلول PBS و2%FBS. بعد ذلك، اجعل الحجم الإجمالي لمعلق الخلايا 10 مل لكل طحال.

قم بتحديد العدد الإجمالي للخلايا ثم قم بطرد الخلايا مركزياً لترسيبها. بعد ذلك، استخدم طقم اختيار سلبي مغناطيسي متاح تجارياً لعزل خلايا الطحال الموجبة لـ CD8 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ثم اغسل الخلايا التائية في PBS.

قم بعدّ الخلايا ثم حضّن من 2 إلى 3 × 10⁵ من الخلايا في 20 µL من الأجسام المضادة الحاجبة mouse CD 1632. بعد 10 دقائق، أضف 20 µL من الأجسام المضادة anti CD eight APC إلى الخلايا لمدة 30 دقيقة، وقم بتقييم نقاء مجموعة خلايا T الموجبة لـ CD eight والمعزولة بواسطة الخرزات المغناطيسية باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك، قم بنقل تبني من 1 إلى 10 × 10⁵ من خلايا OT1 luciferase CD eight positive T إلى فئران albino C 57 black six الساذجة والمحلوقة، وذلك في 200 µL من PBS عبر الحقن الوريدي في وريد الذيل. بعد 24 ساعة، قم بإعطاء اللقاح في عدد الأيام المناسب بعد التطعيم.

احقن الحيوانات بـ 150 milligrams per kilogram من الـ Lucifer بعد مرور 10 دقائق، ثم التقط إشارة الـ bioluminescence لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق باستخدام نظام تصوير الحيوانات الكامل لتصور خلايا OT one Lucifer CD eight positive T cells من أجل تحديد عدد خلايا CD eight positive T cells النوعية للمستضد في الوقت المناسب. بعد التطعيم، اجمع حوالي 100 microliters من الدم من الفئران الملقحة عبر تقنية النزف تحت الفك السفلي في أنبوب مطلي بـ potassium EDTA، واقلب الأنبوب عدة مرات لمنع التجلط. بعد ذلك، انقل 100 microliters من الدم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف one milliliter من CK lysis buffer.

بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق، قم بطرد الخلايا مركزياً وإزالة السائل الطافي. اغسل خلايا pbmc المتبقية في 1 mL من fax buffer وقم بحجب الارتباط غير النوعي باستخدام CD 1632 كما تم توضيحه للتو. بعد 10 دقائق، قسم معلق الخلايا إلى أنابيب fax ذات قاع مستدير سعة 4 mL وأضف 20 µL من H two KB over tetramer syn fecal PE solution إلى كل عينة وفقاً لمواصفات الشركة المصنعة.

بعد 30 دقيقة على الثلج، أضف 20 µL من مزيج الأجسام المضادة المناسب إلى كل عينة تجريبية، وأضف الأجسام المضادة الضابطة لـ fluoro four المنفردة لكل رباعية fluoro four tag أو جسم مضاد إلى كل عينة ضابطة. وأخيراً، بعد فترة حضانة أخرى لمدة 20 دقيقة، اغسل جميع العينات في fax buffer ثم أعد تعليق الرواسب في fax buffer مدعم بـ DPI، وقم بتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتيح CMVs المحملة معاً ببروتينات antigen fluoro four tact والصبغات الدهنية الفلورية تصور تسليم الـ antigen والجسيمات النانوية في الجسم الحي. على سبيل المثال، يشير التصوير بالمجهر البؤري إلى أن الـ antigen الذائب الذي يتم تسليمه تحت الجلد عند قاعدة الذيل، يصل إلى العقد اللمفاوية التصريفية في غضون أربع ساعات من الإعطاء ويتم التخلص منه خلال 24 ساعة.

وفي المقابل، يتم الكشف أولاً عن I CMVs المحملة بشكل زائد عند محيط العقد اللمفاوية المصرفة بحلول 24 ساعة بعد الإعطاء، مع استمرار التراكم الذي يؤدي إلى ترسب كمية كبيرة من ova I CMVs داخل النسيج اللمفاوي المصرف. وبحلول اليوم الرابع، يُظهر التصوير بالتلألؤ الحيوي لفئران C 57 BL six التي نُقلت إليها تكييفياً خلايا OT one Luciferase CD eight positive T cells في يوم التطعيم مستوى خلفية أدنى من OT one luciferase tcell بحلول اليوم الرابع بعد التطعيم. ومع ذلك، تظهر الفئران التي تم تحصينها بـ ova MPI CMVs إشارة تلألؤ حيوي قوية داخل العقد اللمفاوية الأربية المصرفة.

من ناحية أخرى، تُظهر الفئران التي تم تطعيمها ببروتين ova الذائب تمدداً منخفضاً للغاية في خلايا T الموجبة لـ CD8 وOT one Lucifer داخل العقد الليمفاوية التصريفية. علاوة على ذلك، فإن الفئران التي تم تحصينها ببروتين ova الذائب وMPLA دون أي نقل تبني لخلايا T النوعية للمستضد لا تظهر تمدداً ملموساً في خلايا T الموجبة لـ CD8 النوعية لـ ova، كما يتضح من المراقبة الأسبوعية لـ pbmc. ومع ذلك، فإن التطعيم بـ ICMV يحفز استجابة أقوى بكثير وداخلية من خلايا T الموجبة لـ CD8، حيث تصل إلى ذروتها بنسبة 28% من خلايا T الموجبة لـ syn fecal tetramer ضمن مجموعة خلايا T الموجبة لـ CD8 بين pbmc بحلول اليوم 41. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تخليق الجسيمات النانوية القائمة على الدهون، وإجراء التحصينات، وتصور وقياس تمدد CTL في الجسم الحي.

يمكن تعديل هذه الطرق بشكل إضافي للكشف عن معلومات إضافية حول استجابة CTL. على سبيل المثال، يمكن تعزيز مقايسة صبغ teer بعلامات إضافية مثل CD 1 27 وBCL two وK lrg one لتقييم النمط الظاهري للذاكرة في الخلايا.