تقنية التخصيب الأمثل للعزل الفصلاء أنواع الجراثيم من عزلات عينة التربة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مراحل بكتيريا الضربات المفصلية من عينات التربة باستخدام بروتوكول التخصيب. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع عينات التربة أولا وعزل جزيئات العاثيات القابلة للحياة من الكائنات الحية الدقيقة الملوثة للتربة. الخطوة الثانية هي إصابة الخلايا البكتيرية المفصلية المضيفة بجزيئات العاثية المعزولة.

بعد ذلك ، يتم طلاء الخلايا البكتيرية المصابة على ألواح المثقاب لتحديد العاثية كما يتضح من تكوين البلاك. الخطوة الأخيرة هي تنقية العاثيات المرغوبة من اللويحات المعزولة بوضوح باستخدام طريقة لوحة الخط. في النهاية ، تم تحسين تقنية التخصيب هذه من أجل العزل السهل نسبيا للعاثيات الرباعية من أنواع الضربات المفصلية KY 3 9 0 1.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق التخصيب الحالية هي إضافة عينة تربة مصفاة بدقة إلى مزرعة نقية للبكتيريا المضيفة لتجنب نمو البكتيريا المنافسة. على الرغم من أن هذه الطريقة قد أثبتت فعاليتها في عزل العاثيات المفصلية ، إلا أنها يجب أن تكون قابلة للتطبيق لعزل العاثيات عن مضيفات البكتيريا الأخرى. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما علمنا أن باحثين آخرين يواجهون صعوبة في العثور على العاثيات الرباعية.

بتقنيات التخصيب التقليدية. سيوضح طلابي التقنيات المستخدمة لعزل العاثيات المفصلية بنجاح. يتم استزراع خلايا الضربات المفصلية من مستعمرات مخططة على صفيحة مثقاب LB ، محضنة عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

استخدم حلقة معقمة لاختيار مستعمرة وإضافتها إلى 50 مل من مرق رطل. في ثقافة محيرة ، احتضان القارورة في حاضنة اهتزازية عند 225 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تقريبا. للحصول على خلايا الطور الثابت الأسي أو المبكر لتجارب عدوى العاثيات.

راقب حالة نمو البكتيريا عن كثب لمنع الخلايا من دخول النمو الثابت المتوسط إلى المتأخر. حالة. يتراوح OD 600 المثالي لعزل العاثيات بين 0.5 و 0.7. نظرا لأن البكتيريا الموجودة في جنس المفصليات هي بكتيريا شائعة في التربة ، فيمكن العثور عليها هي والعاثيات التي تصيبها في معظم أنواع التربة.

اجمع 200 إلى 400 جرام من التربة من الموقع المطلوب. أضف ما لا يقل عن 400 مل من عازلة العاثيات إلى التربة في أكواب كبيرة بما يكفي بحيث يكون ما لا يقل عن 200 مل من العاثية في المادة الطافية ويمكن استخراجها ، وخلطها عن طريق التقليب برفق أو الدوران حتى يتم تعليق التربة والسماح لرواسب التربة بالاستقرار عادة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة بقايا رواسب التربة عن طريق تمرير مستخلص التربة عبر ورق ترشيح عن طريق الترشيح بالفراغ.

أضف أربعة جرامات من مسحوق LB إلى 200 مل من مستخلص التربة المصفى واخلطه لعمل محلول 2٪. مرر المحلول عبر مرشح 0.22 ميكرون عن طريق الترشيح الفراغي للحصول على مرشح معقم. إذا أمكن ، تابع إلى الخطوة التالية على الفور.

ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين العينات المفلترة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل المتابعة. ومع ذلك ، سيتم تقليل عدد جزيئات العاثيات القابلة للحياة باستخدام تقنيات الصرف الصحي ، حيث يتم نقل أجزاء متعددة من 50 مليلتر من خليط مستخلص التربة LB المعقم بالمرشح إلى 250 ملليلتر فردية. تضيف قوارير الاستزراع المعقمة والمحيرة محلول كلوريد الكالسيوم المعقم 2.0 مولار إلى التركيزات النهائية المرغوبة.

نظرا لأن العاثيات المختلفة لمفاصل المفاصل تنمو على النحو الأمثل في ظل ظروف مختلفة من كلوريد الكالسيوم ، ابدأ هذا الإجراء بإضافة واحد إلى 2.5 مل من ثقافة البكتيريا الأسية المتأخرة أو المبكرة إلى كل من القوارير التي تحتوي على خليط مستخلص التربة المعقم بالترشيح. إذا كان OD 600 للثقافة يتراوح بين 0.5 إلى 0.7 ، فاستخدم مليلتر واحدا. إذا كان OD 600 أعلى من 0.7 ، فاستخدم 2.5 ملليلتر.

رج القوارير عند 250 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تقريبا في حاضنة اهتزازية. بعد فترة الحضانة التي تبلغ 24 ساعة ، قم بإزالة قوارير التخصيب من حاضنة الاهتزاز. تمييع عينات التخصيب عشرة أضعاف في العازلة العاثية.

قم بإعداد أنابيب الاستزراع ب 0.5 مل من الثابتة الأسية المتأخرة أو المبكرة. مرحلة ثقافة البكتيريا. أضف كميات مختلفة من خمسة ميكرولتر إلى 500 ميكرولتر من ثقافة التخصيب المخففة إلى أنابيب الاستزراع.

أضف كلوريد الكالسيوم إلى أنابيب الاستزراع لعمل تركيز نهائي بمقدار خمسة ملليلتر يساوي التركيز الموجود في قارورة التخصيب الأصلية. استخدم مجموعة من تركيزات كلوريد الكالسيوم المختلفة للاختيار للعديد من العاثيات ذات التبعيات المختلفة لكلوريد الكالسيوم. أضف 4.5 مل من المثقاب العلوي LB إلى كل أنبوب ثقافة ، واسكب الخليط على طبق مثقاب LB.

حرك برفق لتوزيعه بالتساوي عبر اللوحة واترك المثقاب العلوي يتماسك لمدة 15 دقيقة تقريبا. اقلب الصفائح واحتضانها عند 30 درجة مئوية طوال الليل إلى 48 ساعة. قم بتغيير أوقات الحضانة لتحسين العاثيات الموجودة بعد فحص حضانة لمدة 24 ساعة لتكوين البلاك على الألواح.

تأتي معظم العاثيات المعزولة من صفائح محتضنة عند 30 درجة مئوية عند تركيز كلوريد الكالسيوم من واحد إلى 2.5 ملليمولار بعد فترة حضانة مدتها 24 ساعة ، وتنقية العاثيات المرغوبة من لويحات معزولة بوضوح باستخدام عصا خشبية باعتبارها الجزء الأكثر تحديا في هذا الإجراء. مطلوب خبرة فنية لنشر اللويحات برفق عبر لوحة المثقاب لإنتاج صفيحة خط موحدة. عقم عصا خشبية عن طريق تمريرها عبر اللهب والسماح لها بالتبريد.

المس لوحة لفترة وجيزة بعصا خشبية معقمة وافرك العصا على لوحة المثقاب بحركة لطيفة كما هو موضح. كرر هذا باستخدام عصا نظيفة لكل تمريرة. بمجرد أن يتم رسم لوحة المثقاب LB ثلاث مرات على الأقل ، ضع علامة على المنطقة التي تحتوي على أقل تركيز لجزيئات العاثيات المفترضة.

ضع برفق 0.5 مل من المفصليات و 4.5 مل من المثقاب العلوي LB المنصهر على المنطقة المحددة ، واتركه ينتشر بالتساوي عبر اللوحة. دع المثقاب العلوي يتجمد لمدة ساعة على الأقل عندما تصلب اللوحة ، وقلبها واحتضانها طوال الليل. كرر تقنية البلاك الخطي لثلاثة تكرارات على الأقل لضمان عزل أنواع العاثيات النقية.

يمكن تخزين الألواح عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع حسب الحاجة بين الخطوط دون فقدان كبير لقابلية العاثيات للبقاء. بمجرد زراعة اللويحات المرغوبة وعزلها على لوحة الخط النهائية ، المس لوحة معزولة جيدا بطرف ماصة دقيقة وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من العاثية العازلة بشكل متسلسل ، وقم بتخفيف هذا المحلول إلى 10 إلى سالب الثامن عن طريق تمرير 20 ميكرولترا من العينة إلى 180 ميكرولترا من العاثية الطازجة. أضف 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى 0.5 مل من المفصليات المزروعة في أنبوب استزراع لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بخلط البكتيريا المصابة مع 4.5 مل من المثقاب العلوي LB المنصهر الذي يحتوي على نفس تركيز كلوريد الكالسيوم المستخدم لعزل العاثية من عينة التربة الأصلية. احتضن الأطباق بين عشية وضحاها. احتفظ بكل التخفيف الذي تم إجراؤه عند أربع درجات مئوية حتى اليوم التالي.

حدد تخفيف حبوب العاثية اللازمة لإنشاء نمط ويب باستخدام مقايسة عيار البلاك التقليدية. حدد لوحة نمط الويب على أنها خالية في الغالب من البكتيريا ولكنها تحتوي على بقايا البكتيريا التي لم يتم ربطها بعد بواسطة العاثيات. أضف خمسة ملليلتر من ثقافة المفاصل الأسية المتأخرة أو الثابتة المبكرة إلى قارورة استزراع معقمة سعة 50 مل.

أضف 100 ميكرولتر من التخفيف الذي أعطى نمطا شبكيا لثقافة الضربات المفصلية ويسمح للعاثيات بإصابة خلايا البكتيريا لمدة خمس إلى 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أضف إلى القارورة المنصهرة رطل المثقاب العلوي الذي يحتوي على نفس تركيز كلوريد الكالسيوم المستخدم في البداية لتحديد لوحة العاثية. خمسة ملليلتر من هذا الخليط على كل من 10 أطباق رطل طازجة.

بعد السماح للمثقاب العلوي بتصلب الألواح وعكسها واحتضانها عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها في اليوم التالي ، قم بإغراق ألواح نمط الويب بخمسة ملليلتر من العاثية المؤقتة لكل لوحة وتخزينها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قم بتصفية محللة العاثية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون. قم بتخزين مخزون العاثيات النهائي هذا عند أربع درجات مئوية للتخزين طويل الأجل.

أضف كمية متساوية من محللة العاثية إلى الجلسرين المعقم في قوارير صغيرة لأرشفة المخزون عند 80 درجة مئوية تحت الصفر في إجراء التخصيب الموضح في هذا الفيديو ، طريقة خط البلاك لعزل مجموعات العاثيات النقية بعد التخصيب الأولي والطلاء على مثقب LB الموضحة هي نتائج تمثيلية من عزل لويحات العاثية DI في درجة حرارة الغرفة ، 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية. تحيط الدوائر الحمراء الموجودة على اثنين من اللوحات بلوحات معزولة بوضوح. ينتج العاثية ديلان لويحات مماثلة في ثلاث درجات حرارة مختلفة.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مقايسة عيار البلاك القياسية التقليدية لعزل العاثية النقية. تم استخدام هذا الاختبار هنا لتحديد أرقام عطور العاثيات تجريبيا وعدد وحدات تشكيل البلاك لتشكيل نمط حزام على لوحة. يتم عرض مجموعة من التخفيف التسلسلي للموز العاثية مع مثال على الشكل الذي يجب أن يبدو عليه نمط الويب الجيد.

هذه صور مجهرية إلكترونية ل 20 عاثية مفصلية معزولة باستخدام تقنية التخصيب. من بين 25 العاثية المعزولة حاليا ، 23 منها فيروسات cifo ذات ذيول طويلة إلى حد ما. اثنان من العاثيات المعزولة عبارة عن فيروسات عضلية تحتوي على أقطار رأس مماثلة في الطول لأقطار ذيولها.

بمجرد إتقانها ، يجب أن يسمح طلاء التخصيب بالعزل الناجح للعاثيات المفصلية من مجموعة متنوعة من عينات التربة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية العاثية المستخدمة في طريقة الطلاء الخطي من عينة التربة البيئية.