قياس خارج الخلية ايون تدفقاتها باستخدام ايون انتقائية مسرى مكروي تقنية الرجوع الذاتي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تدفقات الأيونات خارج الخلية في الجسم الحي (in vivo) باستخدام تقنية القطب المجهري ذاتي المرجعية والانتقائي للأيونات. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجميع الأقطاب المجهرية المرجعية وتلك الانتقائية للأيونات، ثم تأتي الخطوة الثانية وهي معايرة الأقطاب المجهرية ذاتية المرجعية والانتقائية للأيونات والتحقق من دقتها.

بعد ذلك، يتم إجراء قياسات التدفق الأيوني النوعي على العينة البيولوجية في شكل تسجيلات للجهد الكهربائي. وأخيرًا، يتم تحويل تسجيل الجهد إلى تدفق أيوني. وفي النهاية، تتيح هذه التقنية قياسًا دقيقًا وغير جراحي لتدفقات أيونية محددة خارج الخلية في الخلايا أو الأنسجة الحية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في الفسيولوجيا أو الشيخوخة، وكذلك في التجدد أو علم الأمراض. على سبيل المثال، تسمح هذه الطريقة بتحديد تدفقات أيونية محددة، والتي تتحكم في عمليات بيولوجية مثل نمو تشكل الأنسجة أو تمايزها. سيقوم بشرح هذا الإجراء كل من د. جيم أردي، وهو باحث ما بعد الدكتوراه، ومختبر د. بنجاس. قبل معايرة القطب الكهربائي، قم بتثبيت قطب كهربائي انتقائي للأيونات مملوء مسبقاً في حامل أقطاب دقيقة مجهز بموصل ذهبي ذكري بمقاس 1 mm وسلك فضي مطلي بكلوريد الفضة.

بعد ذلك، قم بتثبيت حامل القطب الكهربائي الدقيق بموضع دقيق إلكتروني ثلاثي المحاور يتم التحكم فيه بواسطة الحاسوب. يجب أن يحتوي القطب الانتقائي للأيونات ذاته بالفعل على الإلكتروليت ومحلول مزيج الأيونات الأربعة المتعلق بالأيونات المستهدفة. وبمجرد التثبيت، يجب غمر القطب في محلول يحتوي على 1 millimolar من كلوريد البوتاسيوم.

بالإضافة إلى ذلك، قم بتركيب القطب المرجعي في حامل أقطاب دقيقة مستقيم يحتوي على محلول ملحي بتركيز 3 molar في الآجار، وكريّة فضة مطلية بـ silver chloride، وموصل ذهبي ذكري بمقاس 2 millimeter للقطب المرجعي. يعتمد اختيار المحلول الملحي على نوع الأيون المراد قياسه. بعد تحضير القطب المرجعي، قم بتوصيل حامل القطب بموضع دقيق يدوي (manual micro positioner) مثبت مسبقاً على حامل مغناطيسي.

بمجرد تثبيته، يجب غمر القطب الكهربائي في محلول يحتوي على 1 millimolar من كلوريد البوتاسيوم. وقبل البدء، يجب تحضير سلسلة تخفيف من معايير معايرة الإلكتروليت التي تحتوي على الأيونات المراد قياسها باستخدام إعداد القطب الانتقائي للأيونات. على سبيل المثال، إذا كان الهدف هو الكشف عن كاتيون البوتاسيوم بتركيز فسيولوجي يبلغ حوالي 1 millimolar، فقم بتحضير سلسلة من ثلاثة تدرجات لوغاريتمية من محاليل كلوريد البوتاسيوم بتركيزات 10 و 1 و 0.1 millimolar.

يؤدي ذلك إلى زيادة المدى الديناميكي للكشف الذي يتطلبه المقايسة. لمعايرة القطب الانتقائي للأيونات، ابدأ بغمر كل من القطب الانتقائي للأيونات والقطب المرجعي في محلول المعايرة الأقل تركيزاً، وهو في هذه الحالة 0.1 millimolar. وبعد فترة استقرار قصيرة تتراوح من دقيقة إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، قم بقياس وتسجيل جهد الحالة المستقرة.

كرر قياسات الجهد لبقية معايير المعايرة، ثم قم برسم قيم الجهد المقاسة مقابل لوغاريتم التركيزات المولية للأيونات. وبالنسبة لكل محلول معياري، طبق الانحدار الخطي لتحديد قيمة الميل وتقاطع المحور وقيم معامل التحديد (r squared) لمنحنى المعايرة. ولحساب الميل، تذكر قسمة قيم الجهد المقاسة على إجمالي كسب مضخم الجهد.

لتوضيح بروتوكول القياس، سيتم توصيف تدفق أيونات البوتاسيوم من بويضة ضفدع مثقبة باستخدام قطب كهربائي دقيق حساس للبوتاسيوم. قبل البدء في إعداد القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات، قص قطعة بمساحة سنتيمتر واحد من شبكة نايلون بقطر 800 ميكرون وألصقها في طبق بتري بلاستيكي. كما يجب تحضير محلول رينجر المعدل لـ mark مسبقاً بالتركيبة التالية: 100 millimolar كلوريد الصوديوم، 2 molar كلوريد البوتاسيوم، 2 millimolar كلوريد الكالسيوم، 1 millimolar كلوريد المغنيسيوم، و5 millimolar من HEPES. اضبط pH للمحلول المنظم إلى 7.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم، وأضف كمية من المحلول المنظم المكتمل إلى طبق بتري.

ضع بعناية خلية الضفدع والقطب الكهربائي الانتقائي للأيونات والقطب المرجعي في طبق بيتري. بعد ذلك، قم بثقب الخلية وتشغيل جهاز تحديد الموقع الدقيق، بحيث يكون القطب الكهربائي الانتقائي للأيونات على بُعد حوالي 10 microns من العينة. ومن حيث التسمية، ستُسمى المسافة الحالية بين العينة والقطب الكهربائي بالوضعية القريبة.

بعد ذلك، قم بتشغيل جهاز تحديد المواقع الدقيق بحيث يتنقل القطب الانتقائي للأيونات بشكل دوري من الموضع القريب البالغ 10 microns إلى موضع أكثر بعداً يبلغ 100 microns، ثم يعود إلى الموضع القريب بمعدل 0.3 hertz، أو بعبارة أخرى، ثلاث رحلات كاملة كل 10 ثوانٍ. أثناء تشغيل جهاز تحديد المواقع الدقيق، تحقق من أن حركة القطب عمودية تماماً على السطح المماسي المصاب للخلية، ثم قم بتفعيل برنامج قياس وتسجيل الجهد الكهربائي. تم برمجة جهاز تحديد المواقع الدقيق للتوقف لفترة وجيزة عند الموضعين القريب والبعيد أثناء جمع بيانات الجهد الكهربائي.

يتم تسجيل البيانات بشكل مستمر أثناء التئام جروح البويضة، وهو ما يستغرق حوالي 15 دقيقة؛ أما في التجارب الأطول، مثل مراقبة عملية متعددة الأيام أثناء قياسات تجدد ذيل شرغوف opus، فيتم تسجيل القياسات لمدة دقيقتين في نقاط زمنية مختلفة، على سبيل المثال: 1، و3، و6، و12، و24 ساعة. عند الانتهاء من التجربة، استخرج بيانات الجهد الكهربائي كملف نصي وانسخ القيم في جدول بيانات.

استخدم منحنى المعايرة الذي تم تحديده مسبقاً لتحويل قيم الجهد المقاسة إلى تركيزات الأيونات المقابلة لها. قم برسم تركيزات الأيونات المستنبطة كدالة للمسافة بعيداً عن العينة البيولوجية. وأخيراً، احسب التدفق الأيوني باستخدام قانون الانتشار الثابت.

حيث تمثل C تركيز الأيونات في المحلول، وMU حركية الأيونات، وDC DX فرق التركيز عبر المسافة dx. وقبل إجراء التجارب البيولوجية، يمكن التحقق من قيمة تقاطع ميل NER ومنحنى المعايرة الكامل للقطب الانتقائي للأيونات مقابل تدرج أيوني اصطناعي يتم إنشاؤه من مصدر أيوني بتركيز 1 molar يوضع في طبق بتري. وذلك عند رسم التغيرات في تركيزات أيونات البوتاسيوم على مسافة قريبة من موقع الجرح أو بعيدة عنه.

تشير البيانات إلى حدوث تدفق هائل للبوتاسيوم عند بداية إصابة الخلية، ومع تقدم عملية التئام الجرح، يتناقص تدفق البوتاسيوم تدريجياً ليعود إلى مستوياته الساكنة بعد 15 دقيقة عندما يلتئم الجرح تماماً. علاوة على ذلك، عند تحويل تركيزات أيونات البوتاسيوم المقاسة إلى تدفق أيوني، يظهر أن الزيادة المفاجئة والنقصان التدريجي في تدفق البوتاسيوم بعد الإصابة يمثلان تأثيراً ذا دلالة إحصائية عند مقارنتهما ببويضة تحكم سليمة. وبعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل وسم الكهرباء الحيوية الفلوري للإجابة على أسئلة إضافية حول خصائص تدفقات الأيونات بين الخلايا وداخل الخلية الواحدة.