تذرية الكبدية محددة في الزرد لدراسة يحركها صفراوية تجديد الكبد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز استئصال خلايا الكبد في أسماك الزرد لتحليل تجديد الكبد الذي يحركه القناة الصفراوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعريض اليرقة المعدلة وراثيا التي تعبر عن اختزال النيترو في خلايا الكبد إلى المترون أو MTZ. في الخطوة الثانية ، يتم تقييم مستوى استئصال خلايا الكبد بناء على الحجم النسبي للكبد.

بعد علاج MTZ في الخطوة الأخيرة ، يتم جمع اليرقات المستعصصة بالتنمر مع كبد صغير ، وفي النهاية يتم قياس حجم الكبد والتعبير عن علامات الكبد في الكبد المتجدد عن طريق مضان epi والفحص المجهري متحد البؤر على التوالي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل نماذج تنشيط الخلايا البيضاوية للقوارض هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يتم اشتقاق خلايا الكبد المتجددة بشكل أساسي من الخلايا الظهارية الصفراوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجديد الكبد ، مثل كيف تساهم الخلية السلفية الصفراوية أو السلفية في الكبد بشكل عام ، سيكافح الفرد إلى الجديد في هذه الطريقة لأن حجم الكبد في مختبر الرصاص والتحلل متغير.

لإجراء التزاوج في الوقت المناسب ، قم بإعداد الأسماك البالغة من الذكور والإناث أو أسماك متماثلة اللواقح بين عشية وضحاها مع وجود فاصل بينهما. قم بإزالة الحاجز في صباح اليوم التالي عندما يكون التزاوج مرغوبا فيه ، باستخدام مصفاة شبكية بلاستيكية دقيقة لحصاد الأجنة ، اقلب المصفاة رأسا على عقب واستخدم زجاجة ضغط لشطف سطح الشبكة بتيار ناعم من ماء البيض. ثم انقل ما يصل إلى 100 جنين إلى طبق بتري سعة 100 ملم يحتوي على 25 مل من ماء البيض ، وضع الطبق على حرارة 28 درجة مئوية لمنع التصبغ.

أضف PTU إلى الثقافة لمدة تصل إلى 10 ساعات. بعد الإخصاب في 80 ساعة. بعد التخصيص ، قم بتخدير اليرقات باستخدام trica واستخدم مجهر Epi الفلوري لجمع يرقات CFP الإيجابية ، مع الاحتفاظ فقط بالحيوانات ذات الكبد المتشابه الحجم.

ثم استبدل ماء بيض التريكا بماء البيض العذب المكمل ب PTU وأعد يرقات سمك الزرد الإيجابية CFP إلى حاضنة 28 درجة مئوية. لمعالجة يرقات الزرد ب MTZ أولا ، قسم العدد المناسب من اليرقات إلى وعاءين مختلفين للاستزراع. احتفظ بمجموعة اليرقات التجريبية في محلول MTZ المحضر حديثا والمجموعة الضابطة في ماء البيض.

مكمل مع DMSO. قم بتغطية المجموعة التجريبية بورق الألمنيوم لمنع تعطيل الصور ل MTZ واحتضان كلتا المجموعتين من يرقات الزرد عند 28 درجة مئوية في نهاية فترة الاستئصال. قم بإزالة محلول MTZ من الأطباق واغسل اليرقات المعالجة MTZ مرتين إلى ثلاث مرات ب 25 مل من ماء البيض وقم بتدوير ماء البيض والتخلص من ماء البيض بعد كل غسلة.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتثبيت اليرقات بنصف تركيز التريكا المستخدم سابقا لتجنب وذمة القلب والموت في اليرقات المعالجة ب MTZ. ثم استخدم مرشح CFP على مجهر مضان epi لتقييم مستويات استئصال خلايا الكبد بناء على حجم الكبد النسبي لليرقات المعالجة ب MTZ. ضع في اعتبارك أن أسماك الحمار الوحشي ذات الكبد الكبير التي تمثل صفر إلى 5٪ من اليرقات غير مستعصية.

أولئك الذين لديهم كبد متوسط الحجم يمثل 10 إلى 20٪ من اليرقات يجب استئصالها جزئيا وتلك التي تحتوي على كبد صغير جدا تمثل 80 إلى 90٪ من اليرقات يجب استئصالها بالكامل. بعد تصنيف جميع ، اكتشف اليرقات ذات الكبد غير المفصول أو المفصول جزئيا ، مع الاحتفاظ فقط بأسماك الحمار الوحشي ذات الكبد الصغير الذي يشير إلى استئصال شديد لخلايا الكبد لتحليل الكبد. عند نقطة زمنية التجديد صفر ساعة ، انقل اليرقات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

مباشرة بعد غسل MTZ ومصادر CFP ، استبدل ماء البيض بمحلول MPEM فورمالديهايد 3٪ للتثبيت طوال الليل على دوار أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، استبدل محلول التثبيت بملليلتر واحد من P-B-S-D-T وقم بتدوير اليرقات لمدة خمس دقائق إضافية. بعد ذلك ، يتم وضع جميع اليرقات الثابتة في طبق بتري 100 ملم يحتوي على P-B-S-D-T الطازج تحت مجهر تشريح واستخدام الملقط لإزالة صفار البيض والزعانف الصدرية يدويا عند قص جميع اليرقات.

انقل ما يصل إلى 20 إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر واستبدل P-B-S-D-T بمليلتر واحد من محلول الحظر. بعد ساعتين على المدور في درجة حرارة الغرفة ، استبدل محلول الحجب ب 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الأساسي لحضانة ليلية عند أربع درجات مئوية. مع التأرجح في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل أسماك الحمار الوحشي ب P-B-S-D-T لمدة خمس غسلات لمدة 10 دقائق.

بعد الغسيل الأخير ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الهزاز. أخيرا ، اغسل اليرقات خمس مرات في P-B-S-D-T كما هو موضح للتو. قم بتوجيه اليرقات بشكل جانبي على شريحة مجهرية وأضف قطرة من وسائط التثبيت.

ثم قم بتغطية كل سمكة حمار وحشي بعناية بغطاء زجاجي وأغلق زجاج الغطاء بطلاء الأظافر. يقلل علاج MTZ لمدة 36 ساعة من 3.5 إلى خمسة أيام بعد الإخصاب بشكل كبير من حجم الكبد. بعد غسل MTZ ، يظهر CFP قوي وتعبير أحمر مرة أخرى في غضون 30 ساعة ، في الواقع ، كما تم تقييمه من خلال التعبير عن LCAM في غشاء الخلايا الظهارية الصفراوية.

تنهار الشبكة الصفراوية داخل الكبد في البداية ، ولكن يتم إعادة إنشائها بعد 54 ساعة من الانجراف مما يشير إلى تجديد الكبد سريعا وتعافيه. في هذه الصور ، تظهر خلايا الكبد المتجددة وراثيا لبروتين فلورسنت أحمر نووي معبرا عنه حصريا في الخلايا الظهارية الصفراوية للكبد ، معظم هذه الخلايا H ، اثنتان من الكرز BM ، في الكبد المتجدد ، تعبر عن HNF أربعة ألفا في ساعة التجديد صفر في ساعة التجديد الرابعة C ثمانية. لا تزال خلايا الكبد الإيجابية ل CFP المعالجة MTZ تحتفظ بتعبير الكرز H two BM مما يشير إلى تحويل الخلايا الظهارية الصفراوية إلى خلايا كبدية عند فقدان خلايا الكبد الشديدة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تختار استئصالا كاملا بعد علاج MTT لتجديد الكبد اللاحق عند عمل التحلل بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجديد الكبد لاستكشاف الآليات الكامنة وراء سلف الكبد ، تجديد الكبد الذي يحركه الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نموذج التشغيل الخاص بالخلايا الجغرافية لدراسات تنكس الكبد التي تحركها الصفراوات.