Name: ما يفعل وما يترك في إعداد العضلات Cryosections للتحليل النسيجي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: تعلم إعداد شرائح العضلات المجمدة للتحليل النسيجي باستخدام التجميد السريع في ميثيل البوتان المبرد بالنيتروجين السائل. تضمن هذه الطريقة الحفاظ على بنية الأنسجة بدون تشوهات التجمد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر أليكس ميلر على مراجعات المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية الممنوحة ل M.G. من Cure CMD و Fight Against Mascular Strophy (SAM) و Expcular Dystrophy Association (218938).

1. الأنسجة الحصاد وتجميد الأنسجة العضلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين (2-كلورو-2- (difluoromethoxy) -1،1،1-trifluoro-الإيثان). تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان واستخدام أسلوب الاحتواء الثانوي مثل مجفف أو جرة الجرس تحتوي على قطعة من القطن غارقة في الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد وفاة خلال الضغط بحزم قاطع الطريق. استخدام أسلوب الثانوية للقتل الرحيم مثل خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب الفراء مع الكحول 70٪ للحد من الخلاف من جدائل الشعر فضفاضة على العضلات. قشر الجلد قبالة الطرف باستخدام ملقط غرامة مثل # 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بعناية عضلة الفائدة (الظنبوبي الأمامي (TA) في هذه الحالة) من العظام تحتها، بدءا من وتر وإزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال العضلات، وتغطية ذلك في أكتوبر (قطع الأمثل درجة حرارة المركبة)، ووضع عليه شقة في قالب تجميد المتاح المسمى. تأكد من أن العضلات هي في توجهاته فيزيولوجية طبيعية (الرأس إلى تايل) دون التمدد. بدلا من ذلك، تجميد العضلات على الساحات الستايروفوم صغيرة ويعلقون عليه باستخدام دبابيس الحشرات لضمان طول الصحيح للعضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدئ 2-methylbutane (isopentane) في كوب الصلب باستخدام النيتروجين السائل. هذا يستغرق في المتوسط ​​3-5 دقيقة. الحفاظ على اثارة بشكل متقطع حتى تبدأ الرواسب البيضاء التي تشكل في القاع وجدران الكأس. ملاحظة: عند حدوث ذلك، قد وصلت isopentane الأمثل درجة حرارة التجمد (-150 درجة مئوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع القوالب التي تحتوي على عضلات في برود 2-methylbutane. تجميد العضلات الصغيرة مثل إبهام اليد الحجاب الحاجز والباسطة للأصابع (EDL) ل6-12 ثانية، والعضلات الكبيرة مثل النعلية الساق (GS) وثلاثية الرؤوس لمدة 15 - 20 ثانية. لا تجميد العضلات لفترة طويلة جدا لأن هذا قد يؤدي إلى تكسير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة المجمدة إلى الثلج الجاف، والسماح للتتبخر isopentane (لاحظ أن هذه العملية تستغرق في المتوسط ​​حوالي 15-20 دقيقة). التفاف الأنسجة في رقائق الألومنيوم وتخزينها في شltra درجة حرارة منخفضة (-70 ° C إلى -80 درجة مئوية) حتى باجتزاء. </li></ol> 2. تضمين الأنسجة في أكتوبر لإعداد كتلة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة النقل على الجليد الجاف لcyrostat لمنع ذوبان الجليد. الأنسجة نقل إلى غرفة ناظم البرد (وضعت في -20 إلى -24 ° C لتجنب ذوبان كامل للأنسجة) والسماح لهم تتوازن لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خليج بلتيير تبريد جرا. إذا لم يكن لديك ناظم البرد هذا التبريد، استخدم الهباء الجوي رذاذ التبريد لتجميد بسرعة أكتوبر لا تدع ذوبان العضلات في أي لحظة خلال التضمين وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة طبقة رقيقة موحدة من أكتوبر على القرص العينة وندعه يبرد. عندما يتم تجميد أكثر من أكتوبر على الجزء السفلي في حين لا يزال السائل على الجزء العلوي، وإدراج الأنسجة في الاتجاه الصحيح (عمودي أكتوبر للقطاعات عرضية وبموازاة أكتوبر للالمقاطع الطولية). استخدام الهباء الجوي رذاذ التبريد لتجميد بسرعة أكتوبر تلمس الجزء unembeded من النسيج مع تحويلة الحرارةractor وانتظر لمدة 45 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة طبقة رقيقة أخرى من أكتوبر حول العضلات، ورذاذ مع الهباء الجوي رذاذ التبريد واستخراج الحرارة كما في الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على إضافة أكتوبر بزيادات صغيرة وبسرعة تجميد أكتوبر باستخدام مزيج من الهباء الجوي رذاذ ومستخرج حرارة التبريد حتى يتم تغطية العضلات كلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مستخرج الحرارة في الجزء العلوي من كتلة الأنسجة والانتظار لمدة 5 دقائق. </li></ol> 3. إعداد إنشائية والتعرف على أقسام من منطقة منتصف البطن من العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل العينة على رأس العينة. تشديد مقبض الباب لتأمين القرص. تأكد من أن القرص العينة على اتصال جيد مع رئيس العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة حرارة الغرفة ما بين -21 و -24 ° C وانتظر حتى يتم تحقيق درجة الحرارة المحددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات سمك (7 ميكرون)؛ تقليم الكتلة عن طريق دفع أو سحب كتلة باستخدام إعدادات الخشنة وغرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المقاطعفي مرحلة ما قبل تحسنت-شرائح المجهر موجبة الشحنة عن طريق الضغط على الجزء العلوي من الشريحة على الأقسام، وذلك باستخدام التجاذب بين الشحنات المتضادة لتسهيل انضمام الأقسام خفض إلى الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على أقسام منتصف البطن عن طريق قياس مساحة المقطع العرضي (CSA) من الأقسام. القيام بذلك باستخدام برامج التصوير على الكمبيوتر متصلة المجهر. ملاحظة: يتم التقاط الصور المرحلة التباين ويتم قياس محيط العضلة بأكملها من خلال وظيفة البحث عن المفقودين على برنامج حاسوبي. هذا وسوف تسفر كل من وكالة الفضاء الكندية وكذلك الحد الأدنى قطر النمس (قياس حجم الألياف مستعرضة أن يتم التعبير عن أصغر مسافة بين اثنين من الظلال متوازية على طرفي نقيض من الجسيمات) القياسات. ملاحظة: عندما تبدأ القياسات CSA وقطر الحد الأدنى النمس إلى الهضبة، تم التوصل إلى منتصف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جرد وأرشفة الشرائح في -80 درجة مئوية لمدة تلطيخ المستقبل. ملاحظة: أكتوبر لا تحتاج إلى إزالة قبل staininز الإجراءات. بمجرد coverslipped الشرائح، وأنهم على استعداد لتكون ملطخة على الفور. </li></ol> 4. تلطيخ ملاحظة: في حين خطوة بخطوة الإجراءات التفصيلية ويمكن الاطلاع على ورقة بيانات المنتج وينبغي اتباع إجراءات تلطيخ، قد تكون هناك حاجة الأمثل الشخصية للحصول على تلطيخ الأمثل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بسبب تصاعد وسائل الإعلام (انظر الجدول) ليست غير قابلة للامتزاج مع الماء، ويذوى الشرائح من خلال درجات متزايدة من الكحول (2 دقيقة لكل منهما في 70٪، 95٪، و 100٪ من الإيثانول) واضحة لهم مع الزيلين (100٪ لمدة 5 دقائق) لضمان الشرائح لا تصبح مبهمة مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة الأقسام والسماح لهم الجافة. صورة مع المجهر مجهزة برامج التصوير. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
<li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li>
<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

وقد استخدمت الأنسجة والمناعية كأدوات رئيسية في فهم مظاهر وتطور علم الأمراض في مختلف الاضطرابات العصبية والعضلية. تقليديا، كانت ثابتة الخزعات العضلية لأول مرة في الفورمالديهايد ثم جزءا لا يتجزأ من شمع البرافين. في حين الفورمالديهايد تثبيت يحافظ على بنية الأنسجة ويسمح تخزين الأنسجة والنقل في RT، فإنه يعطل أيضا الإنزيمات والبروتينات crosslinks يستلزم مزيدا من الخطوات لتحقيق المناعية دقيقة. يتم التخلص من هذه المشكلة مع استخدام الأبواب المجمدة ولكن يعرض هذا الأسلوب تحديات تقنية فريدة م...

فحص الأنسجة العضلية يلعب دورا حاسما في فهم أنواع مختلفة من الاضطرابات العصبية والعضلية 1-4. عندما جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى، فإنه يسمح للباحثين للحصول على فكرة أفضل عن مظاهر وتطور علم الأمراض، ويمكن أيضا أن يكون أساسيا لتقييم فعالية التدخل العلاجي 10/05. ومع ذلك، لتكون دقيقة، تحتاج الأنسجة الى الحفاظ عليها بطريقة سليمة وذلك للحفاظ على الحالة الفسيولوجية على الفور قبل الختان. وهذا يتطلب عناية كبيرة خلال إزالة والحفاظ عليها وباجتزاء، وتلطيخ. الأنسجة يمكن إعداد بطريقتين مختلفتين للدراسة المجهرية الخفيفة. الطريقة الأولى، الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) أقسام، يتطلب الأنسجة لتكون ثابتة في 10٪ الفورمالديهايد مخزنة الطبيعي قبل أن يتم دمجهم مع شمع البارافين 11،12. الخطوة تثبيت تساعد على الحفاظ على التشكل أفضل ولكن أيضا عبر الروابط والعلاقات العامة المحليةoteins مما يستلزم إجراءات استرجاع مستضد المعقدة لالمناعية والقضاء على إمكانية الأنزيمية تلطيخ على هذه المقاطع 12. أقسام المجمدة، من ناحية أخرى، لا تحتاج إلى أن يكون ما قبل ثابتة أو معالجتها. لذلك، البروتينات هي قادرة على الاحتفاظ التشكل البيولوجية الأم 13،14. وعلاوة على ذلك، الأبواب المجمدة تسمح أيضا للمرة تحول سريع، وهو في أوقات الضرورة، على سبيل المثال في التشخيص أثناء العملية من الأورام اللحمية وخزعات جراحية أخرى 15. ومع ذلك، إذا لم ينفذ بشكل سليم، وهذا الأسلوب هو عرضة للتجميد الضرر الذي يدخل تغييرات على بنية العضلات مما يجعل الأجزاء غير صالحة للفحص النسيجي. وهذه الورقة تحدد الأسلوب الأكثر فعالية لإعداد الخزعات العضلية من أجل تحقيق تلطيخ الأمثل للفحص الصحيح.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>بوفالو جروف ، إلينوي 60089 الولايات المتحدة الأمريكية ، هاتف المكتب 1-800-248-0123 البديل: ريتشارد ألين ساینتفيك</td></tr><tr><td>مجهر</td><td>نيكون اكليبس 50i</td><td>نيكون إنسترومنتس، إنك.</td><td>1300 طريق والت ويتمان ، ميلفيل ، نيويورك 11747-3064 الولايات المتحدة الأمريكية ، الهاتف: 1-631-547-8500 البديل: أوليمبوس</td></tr><tr><td>برنامج تحليل الصور</td><td>برنامج التصوير نيكون البحوث الأساسية</td><td>نيكون إنسترومنتس، إنك.</td><td>1300 طريق والت ويتمان ، ميلفيل ، نيويورك 11747-3064 ، الولايات المتحدة الأمريكية ، الهاتف: 1-631-547-8500 البدائل: الصورة J ، التحول</td></tr><tr><td>إيزوفلوران</td><td>14043-220-05</td><td>دينار أردني القسم الطبي المحدود.</td><td>1923 شارع ويست بيوريا ، فينيكس ، أريزونا 85029 الولايات المتحدة الأمريكية</td></tr><tr><td>أكتوبر</td><td>4583</td><td>شركة ساكورا</td><td>Torrence، CA 90501 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>قم بتجميدها</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس ، 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: قالب</td></tr><tr><td>الأنسجة القابل للتصرف</td> VWR <td>Scientific 22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، Cambridge ، MA 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، Cambridge ، MA 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street ، سانت لويس ، MO 63103 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethyl الكحول</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-ميثيل البوتان</td><td>M 32631-SL</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>3050 شارع التنوب ، سانت لويس ، ميزوري 63103 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، Cambridge ، MA 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill # 3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr ، كامبريدج ، ماساتشوستس 02139 الولايات المتحدة الأمريكية المصدر البديل: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

ما يفعل وما يترك في إعداد العضلات cryosections للتحليل النسيجي

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

وقد خدم التقييم النسيجي للخزعة العضلات كأداة لا غنى عنها في فهم تطور وتقدم من أمراض الاضطرابات العصبية والعضلية. ومع ذلك، من أجل القيام بذلك، تحتاج الرعاية المناسبة الواجب اتخاذها عند استئصال والحفاظ على الأنسجة لتحقيق تلطيخ الأمثل. أسلوب واحد من الحفاظ على الأنسجة ينطوي على تحديد الأنسجة في الفورمالديهايد ومن ثم دمجها مع شمع البارافين. هذا الأسلوب يحفظ التشكل بشكل جيد ويسمح للتخزين طويل الأجل في RT لكن هو مرهق ويتطلب التعامل مع المواد الكيميائية السامة. وعلاوة على ذلك، النتائج الفورمالديهايد التثبيت في مستضد عبر ربط، وهو ما يتطلب بروتوكولات استرجاع مستضد لالمناعية فعالة. على العكس من ذلك، لا يتطلب باجتزاء المجمدة التثبيت وبالتالي يحتفظ البيولوجي التشكل المستضد. يوفر هذا الأسلوب أيضا ميزة واضحة بدوره سريعة حول الوقت، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص في الحالات التي تحتاج إلى تقييم النسيجي سريع مثل intraoperaموانع الخزعات الجراحية. نحن هنا وصف الأسلوب الأكثر فعالية لإعداد خزعات العضلات التصور مع مختلف البقع النسيجية والمناعية.

ويمكن رؤية مجموعة المتابعة للحصاد وتجميد الأنسجة في الشكل 1. يجب أن يتم تخزين الأنسجة رفعه على الشاش غارقة في برنامج تلفزيوني لتجنب تجفيف (الشكل 1A). عندما يتم اختيار الأنسجة ليتم استخدامها للتحليل النسيجي ينبغي أن تراجع في أكتوبر وضعت على البرد العفن في الاتجاه الصحيح وأقرب إلى طول الفسيولوجية ممكن لضمان التشكل دقيقة (الشكل 1B). لا يمكن أن يتحقق من الطين isopentane مناسبة لتجميد الأنسجة عن طريق isopentane التبريد في النيتروجين ال...

هنا نوضح أكثر الطرق فعالية لتجميد خزعات العضلات وتضمينها وتقطيعها بالتبريد وتلطيخها لتجنب تجميد القطع الأثرية.

ما يفعل وما يترك في إعداد العضلات Cryosections للتحليل النسيجي

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجنب الأخطاء الشائعة عند تحضير المقاطع المجمدة من خزعات العضلات، مثل تكوين عيوب التجميد. ويتم تحقيق ذلك من خلال تجميد العضلة بسرعة أولاً في مادة methyl butane المبردة بالنيتروجين السائل. وبعد توازن خزعات العضلات في جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat)، يتم تضمينها في وسط درجة حرارة القطع المثالية (optimum cutting temperature medium) في درجة حرارة الغرفة على زيادات صغيرة مع التجميد السريع باستخدام التبريد بالرذاذ واستخلاص الحرارة.يتم بعد ذلك تقطيع مقاطع بسمك سبعة ميكرون ونقلها إلى شرائح زجاجية دافئة ومشحونة إيجابياً. والخطوة النهائية هي صبغ مقاطع الأنسجة حسب الحاجة لتقييم النسيجية الخاصة بها. وفي النهاية، تؤدي خزعات العضلات المُحضرة بشكل صحيح إلى الحصول على نسيجية محفوظة جيداً دون وجود عيوب تجميدية.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية الأخرى، مثل تقطيع الأنسجة المضمنة في البارافين، في كونها سريعة جداً ولا تؤدي إلى تغيير بنية أو وظيفة المستضدات الداخلية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في بيولوجيا العضلات في حالتي الصحة والمرض، مثل النمو والتجدد والالتهاب والتليف والنخر. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج أو تشخيص اضطرابات العضلات لأنها تتيح تحديد حالة العضلات السليمة والمصابة.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الأشكال المختلفة من الحثل العضلي، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الدنف المرتبط بالمراحل النهائية من السرطان ومرض نقص المناعة المكتسبة وفقدان العضلات لدى كبار السن. ابدأ بقتل فأر عن طريق جرعة زائدة من isof fluorine تحت غطاء سحب الأدخنة وفي مستوى ثانٍ من الاحتواء، مثل الوعاء الزجاجي (bell jar). تأكد من موت الحيوان عن طريق الضغط بقوة على وسادة قدمه.الآن، قم بترطيب الفراء باستخدام 70% alcohol. يمنع ذلك خصلات الشعر السائبة من الالتصاق بالعضلات. تابع ذلك بتقشير الجلد عن الطرف باستخدام ملقط دقيق مقاس 5.افصل العضلة المستهدفة بعناية عن العظم بدءاً من الوتر. في هذه الحالة، يتم عزل العضلة الظنبوبية الأمامية (tibias anterior). بعد استئصال العضلة، غطّها بمركب OCT وضعها بشكل مسطح على قالب تجميد مخصص للاستخدام مرة واحدة ومصنف ببيانات.سيتم إضافة المزيد من مركب OCT لاحقاً قبل عملية التقطيع. تأكد من أن العضلة في وضعها الفسيولوجي الطبيعي على طول المحور الممتد من الرأس إلى الذيل، ومن أنها غير مشدودة. الآن، قم بتبريدها.ضع كمية من الـ isop pentane في بيكر فولاذي باستخدام النيتروجين السائل. قلبه بشكل متقطع لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق باستخدام ملعقة بلاستيكية. عندما يتكون راسب أبيض، يكون الـ isop pentane قد وصل إلى درجة حرارته المثالية؛ عند هذه النقطة، اغمر القوالب المحملة في المحلول.تتطلب العضلات الصغيرة، مثل الحجاب الحاجز والعضلة الباسطة للأصابع الطويلة، من 6 إلى 12 ثانية. أما العضلات الأكبر فتتطلب من 15 إلى 20 ثانية، حيث يمكن أن يؤدي التجميد المفرط إلى حدوث تشققات. الخطوة التالية هي وضع الأنسجة المجمدة على الثلج الجاف للسماح بتبخر isop pentane المتبقي، وهو ما يستغرق حوالي 15 إلى 20 دقيقة.بمجرد جفاف النسيج، قم بلفه في ورق قصدير واحفظه في مجمد بدرجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت تقطيعه. وقبل عملية التقطيع، انقل الأنسجة المجمدة على الثلج الجاف إلى جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat).انقل الأنسجة إلى حجرة جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat) المضبوطة بين -24 و -20 درجة Celsius، واتركها لتتوازن لمدة 30 دقيقة. لن تذوب الأنسجة تماماً عند درجة الحرارة هذه. بعد ذلك، قم بتضمين الأنسجة أولاً.إذا كان متاحاً، قم بتشغيل تبريد حجرة بيلتير (Peltier Bay). ثانياً، ضع طبقة رقيقة ومنتظمة من مركب OCT على قرص العينة واتركه ليبرد. ثالثاً، بمجرد أن يتجمد مركب OCT في الأسفل مع بقائه سائلاً في الأعلى، أدخل النسيج، ووجه النسيج بشكل عمودي على OCT للحصول على مقاطع مستعرضة، وبشكل موازٍ لـ OCT للحصول على مقاطع طولية.استخدم الآن بخاخ تبريد رذاذي لتجميد الـ OCT بسرعة. بعد ذلك، قم بملامسة الجزء غير المغمور من النسيج بمستخرج حراري وثبته على النسيج لمدة 45 ثانية. لا تسمح للعضلة بالذوبان في أي خطوة خلال هذه العملية.إذا كان جهاز المبرد المجهري (cryostat) لا يحتوي على تبريد بمؤثر بيلتير (peltier bay cooling)، فاستخدم التبريد بالرذاذ لتجميد مركب OCT حول النسيج بسرعة. الآن، أضف طبقة رقيقة أخرى من OCT حول العضلة مع الرش برذاذ التبريد واستخلاص الحرارة كما في الخطوة السابقة. استمر في إضافة OCT بكميات صغيرة وتجميده بسرعة باستخدام مزيج من رذاذ التبريد ومستخلص الحرارة حتى يتم تغطية العضلة بالكامل.ثم ضع مستخرج الحرارة على الجزء العلوي من قالب النسيج وانتظر لمدة خمس دقائق قبل البدء في عملية التقطيع. العينة الآن جاهزة للتثبيت على رأس العينة. أولاً، أحكم ربط المقبض لتأمين القرص.تأكد من أن قرص العينة في تلامس جيد مع رأس العينة بينما تصل درجة حرارة الغرفة إلى ما بين 24- و 20- درجة Celsius. عند وصول الغرفة إلى درجة الحرارة المطلوبة، اضبط سمك الشريحة على 7 microns، ثم ابدأ في تشذيب الكتلة. استخدم ضوابط الضبط الخشن والدقيق لتحريك الكتلة.عندما تصبح المقاطع جاهزة للجمع، اضغط جوانبها العلوية على شرائح مشحونة إيجابياً ومسخنة بواسطة مصباح. إذا تم التجميد بشكل صحيح، يجب أن يكون وجه النسيج أبيض طباشيريًا. ومع ذلك، فإن النسيج الذي تم تجميده بشكل غير صحيح أو الذي ذاب أثناء عملية التثبيت سيظهر باللون الأحمر إلى الوردي.يمكن تخزين الشرائح في المجمد العميق من أجل التحليلات المستقبلية. ويمكن تحديد القسم الأوسط من بطن النسيج عن طريق قياس مساحة المقطع العرضي من صور تباين الطور باستخدام وظيفة التتبع في حزمة برامج التصوير. ويوفر هذا التحليل قياسات كل من المساحة والحد الأدنى لقطر فيريت.عندما تبدأ هذه القياسات في الثبات، يكون قد تم الوصول إلى منتصف البطن. وبينما يوفر المصنعون تعليمات خطوة بخطوة لمعظم بروتوكولات التلوين، قد يتطلب الأمر تحسيناً شخصياً لتحقيق كثافات تلوين مثالية. لا يلزم إزالة الـ OCT.بالنسبة لعملية التلوين، وللحصول على أفضل نتائج التلوين المناعي، تأكد من استخدام غرفة ترطيب. يجب تغطيتها بورق البارافين (perfilm) ووضعها فوق مناديل ورقية مبللة وإغلاقها في صندوق صغير لتجنب جفاف المقاطع. أما أثناء عملية التلوين للشرائح ذات التثبيت الدائم غير الملونة مناعياً، فبعد اتباع بروتوكول التلوين، يتم تجفيف الشرائح عبر تمريرها في درجات تصاعدية من الكحول.نظرًا لأن وسط التثبيت غير قابل للامتزاج بالماء، يتم تنظيف الشرائح بغمرها لمدة خمس دقائق في xylene بتركيز 100%. يضمن ذلك عدم تحول الشرائح إلى حالة معتمة بمرور الوقت. بعد ذلك، يتم الانتقال إلى تثبيت وتصوير قطاعات من منطقة منتصف البطن للعضلات الظنبوبية الأمامية التي تم صبغها.باستخدام الهيماتين والإيوسين. ستظهر المقاطع التي تمت معالجتها بشكل صحيح مورفولوجيا متسقة وتلوينًا متجانسًا، بينما تظهر العضلات التي تمت معالجتها بشكل غير صحيح، سواء بسبب التلف بالتجميد أو الذوبان المبكر، كسور متعددة في المورفولوجيا وتبدو بمظهر يشبه القمح المقطع.كما تم إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على هذه المقاطع. وكانت هذه الصبغات مرضية؛ حيث ظهر الفبرونيكتين باللون الأخضر، بينما ظهر DAPI باللون الأزرق.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم شامل لكيفية تحضير مقطع مجمد جيد من خزعات العضلات لتقييم بنية العضلات. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع إلى خمس ساعات تقريبًا إذا تم تنفيذ جميع هذه الخطوات بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر منع ذوبان العضلات بعد اتباع هذا الإجراء.يمكن إجراء طرق أخرى مثل التلوين المناعي والتهجين الموضعي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل النمو والتجديد.

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

تظاهر في هذا الفيديو هي تقنيات الفلاش تجميد وsectioning الجنينية أنسجة المخ من الماوس. يتم إعطاء نصائح مفيدة لاستخدام ناظم البرد ، بما في ذلك الطرق لحل المشاكل التي يمكن استخدامها في حين قطع لضمان أن ينجم عنها من الأنسجة المقاطع خالية من الشقوق والتشوهات الأخرى.

فلاش التجميد وCryosectioning E12.5 مخ الفأر

&lt; p class = "jove_content"&gt;يصف هذا الفيديو إجراء تجميد الأنسجة العضلية المفاجئة والحصول على أقسامها الرقيقة. يمكن أن تساعد هذه التقنية في دراسة الدنف المرتبط بالسرطان في نماذج الفئران لسرطان القولون.

التجميد المفاجئ للأنسجة العضلية للتقسيم: بروتوكول للحصول على أقسام رقيقة جدا من أنسجة عضلات الفئران المجمدة بسرعة

يتم تسهيل تحليل أنسجة العضلات الهيكلية لتحديد الخصائص الهيكلية والوظيفية والكيميائية الحيوية إلى حد كبير من خلال التحضير المناسب.  يصف هذا البروتوكول الطرق المناسبة لإعداد أنسجة العضلات الهيكلية لمجموعة واسعة من دراسات التنميط الظاهري.

الفرز الأنسجة وتجميد لنماذج من الأمراض العضلات الهيكلية

في هذه المخطوطة ، نقدم منصة عالية الإنتاجية وشبه آلية لعلم التبريد لإنتاج صور مركبة محاذاة لمقاييس استجابة متعددة من عدة جولات من التصوير الفلوري على الأجزاء المجمدة من الأنسجة المعدنية.

عالية الإنتاجية، متعدد صورة Cryohistology من تمعدن الأنسجة

توضح هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة للحث الحاد تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الفئران البالغة والتلاعب اللاحقة للعضلات، مثل التشريح، وتجميد، قطع، وتلطيخ الروتيني، وليف عضلي تحليل منطقة مستعرضة.

تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن

يتم جمع متتالية المقاطع البرد لتمكين التطبيقات النسيجية والإثراء من الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني باستخدام المناطق المجاورة من ماوس واحدة العضلات والهيكل العظمي. يتم الحصول على جودة عالية RNA 20-30 ملغ من cryosections والقياسات المجمعة تتم مقارنة مباشرة عبر تطبيقات.

Cryosectioning المناطق المتاخمة من العضلات الهيكلية واحدة فأرة للالتعبير الجيني والتحليلات النسيجية

يصف هذا البروتوكول إجراء لتجميد الأنسجة العضلية التي تغرق بها مباشرة في النيتروجين السائل. كما يسلط الضوء على هذا البروتوكول cryovial الجديدة التي يمكن أن تجنب "تأثير بطانية" من غاز النيتروجين عندما الاتصالات النيتروجين السائل على سطح الأنسجة من العينة.

A متعدد حفرة Cryovial يزيل تجميد قطع أثرية عندما منغمسين الأنسجة العضلية مباشرة في النيتروجين السائل

ويرتبط البلعمة الذاتية النشطة مع تجديد العضلات المنتجة، وهو أمر ضروري لتنشيط الخلايا الجذعية العضلات (موسك). هنا، ونحن نقدم بروتوكول للكشف في الموقع من LC3، علامة التلقيح الذاتي في ميوس إيجابية موسس من أقسام الأنسجة العضلية من السيطرة والفئران المصابة.

في الموقع تلطيخ إمونوفلورزنت من البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات

وصف هنا هو بروتوكول للمناعة المباشرة من ألياف العضلية الميتة في العضلات. الخلايا الميتة هي نفاذيه للبروتينات المصل ، بما في ذلك الغلوبولين المناعي G (مفتش). الكشف عن امتصاص مفتش من قبل myofibers يسمح لتحديد والتقدير الكمي من ألياف العضلية التي تخضع لنخر بغض المثل عن حاله العضلات.

المناعية انحطاط Myofiber في العضلات الخزعات

يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة لإعداد طيات صوتية للفئران للدراسة العصبية العضلية الهسكيميائية.

إعداد أضعاف الصوتية الجرذ للتحليلات العصبية والعضلية

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن التسلل المفرط للدهون داخل العضلات الهيكلية يؤدي إلى السمية الدهنية ومرض السكري. هنا ، نقدم بروتوكولا كاملا ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، والتلطيخ باستخدام Bodipy ، والحصول على الصور ، وتحليلها ، لتحديد حجم وكثافة وتوزيع قطرات الدهون تحت الخلوية بطريقة محددة من نوع الألياف.

نوع الألياف والتحليل الخاص بالخلايا لمحتوى قطرات الدهون في العضلات الهيكلية

تعلم إعداد شرائح العضلات المجمدة للتحليل النسيجي باستخدام التجميد السريع في ميثيل البوتان المبرد بالنيتروجين السائل. تضمن هذه الطريقة الحفاظ على بنية الأنسجة بدون تشوهات التجمد.

ما يفعل وما يترك في إعداد العضلات Cryosections للتحليل النسيجي

استكشف المزيد من الفيديوهات