الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة في الموقع التهجين
June 17th, 2015
RNA في الموقع (ISH) تصور الحمض النووي الريبي في الخلايا والأنسجة. نوضح هنا كيف يمكن استخدام مزيج من RNAscope ISH مع الكيمياء المناعية أو الأصباغ النسيجية بنجاح للكشف عن mRNAs الموضعية في المحاور في أقسام من أدمغة الفئران والإنسان.
الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف mRNAs الموضعية عن طريق الخطأ في عينات الدماغ البالغة. يتم تحقيق ذلك عن طريق المعالجة المسبقة. يتم إجراء العينات عن طريق الغليان وهضم البروتياز لكشف القناع عن جزيئات الرنا المرسال كخطوة ثانية يتم إجراء التهجين ، تليها خطوات التضخيم والكشف ، والتي تتيح تصور الرنا المرسال محل الاهتمام.
يتم تلطيخ المحاور التالية بالأجسام المضادة أو الأصباغ من أجل التحقق من أن mRNA محل الاهتمام في المحاور. تظهر النتائج وجود TF أربعة mRNA في عينات الدماغ باستخدام إجراءات وعدادات مختلفة للكشف ، وطرق تلطيخ تعتمد على تحليلات الفحص المجهري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة في علم الأعصاب مثل mRNAs التي يتم توطينها وترجمتها بدون exons.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتخليق البروتين داخل المكونات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل التشعبات والخلايا والأنسجة غير العصبية التي يحدث فيها توطين الرنا المرسال. بعد تثبيت شرائح الدماغ ، وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب ، قم بإعداد جرة كوبين تحتوي على 60 مل من محلول استرجاع المستضد واغمر الشرائح في المحلول. بعد ذلك ، املأ دورق سعة لتر واحد بالماء المقطر وضعه في الميكروويف لتخفيف الحرارة.
عند إجراء الكشف عن القناع ، ضع البرطمان المشترك الذي يحتوي على الشرائح ومحلول الاسترجاع في الميكروويف. اغلي الشرائح بقوة عالية لمدة خمس دقائق. مباشرة بعد توقف المحلول عن الغليان ، قم بتسخين الشرائح مرة أخرى بقوة عالية لمدة خمس دقائق إضافية.
اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة بعد التبريد ، اغمر الشرائح في طبق يحتوي على PBS لغسلها ثم كرر الغسيل مرتين أخريين بعد الغسيل ، ضع الشرائح على سطح مستو وأضف قطرتين إلى ثلاث قطرات أو 100 ميكرولتر من DAP B.Probe إلى قسمين أو ثلاثة أقسام للدماغ كعنصر تحكم. لتقييم تلطيخ الخلفية ، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من مسبار الاستهداف إلى الأقسام التجريبية للكشف عن الحمض النووي الريبي محل الاهتمام ، يتم استخدام مسبار يستهدف بقايا 20 إلى 1381 من الفأر TF أربعة RNA هنا. استخدم الملقط لوضع المعلمة فوق الشرائح لتجنب تبخر المسبار.
ثم ضع الشرائح في صندوق الشرائح المرطب داخل فرن التهجين واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد انقضاء وقت الحضانة ، اغسل الشرائح في طبق مع مخزن مؤقت للغسيل لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من كاشف التضخيم MP واحد fl إلى كل شريحة دماغية.
ثم قم بتغطيتها بفيلم بارا فيلم جديد في صندوق الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في فرن التهجين. بعد غسل الشرائح كما كان من قبل ، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من كاشف التضخيم A MP four fl إلى كل شريحة من الدماغ وقم بتغطيتها بالبيرفيل. احتضن الشرائح في صندوق الشرائح عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في فرن التهجين.
اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن غسيل واحد لمدة دقيقتين لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كما كان من قبل بعد الغسيل الأخير ، قم بتغطية كل شريحة ب 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول المانع الذي يحتوي على ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر BSA 100 ملليمولار جلايسين و 0.25٪ تريتون × 100 في PBS ، قم بتغطية كل شريحة مع الطفيلي واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف في محلول مانع إلى الشرائح. يتم استخدام الجسم المضاد للكولين أسيتيل ترانسفيراز هنا بعد تغطية الشرائح مع perfil incubate لمدة يومين عند أربع درجات مئوية.
تأكد من عدم جفاف شرائح الدماغ إذا لزم الأمر ، أعد وضع محلول الأجسام المضادة ل CHATT على شرائح الدماغ بعد 24 ساعة من الحضانة. بعد غسل الشرائح ثلاث مرات في XPBS واحد لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق المناسب من Alexa إلى الشرائح.
قم بتغطيتها بالبارم واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بينما تكون محمية من الضوء بعد انقضاء الساعة. اغسل الشرائح ثلاث مرات في XPBS لمدة خمس دقائق لكل منها كما كان من قبل ، ثم اغسلها مرة واحدة بالماء المقطر. قم بتركيب الشرائح بوسيط تركيب يحتوي على DPI ثم تصور شرائح الدماغ تحت المجهر الفلوري.
بعد تحضير عينات الدماغ البشري المدمجة في البارافين الرسمية والثابتة ، وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول ، قم بإجراء كشف المستضد الناجم عن الحرارة عن طريق غمر الشرائح في محلول معالج مسبق ساخن وغليها لمدة 15 دقيقة. بعد الغسيل ثلاث إلى خمس مرات في الماء المقطر وثلاث إلى خمس مرات في الإيثانول الطازج بنسبة 100٪ ، اترك الشرائح تجف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإجراء كشف المستضد الناجم عن البروتياز. أضف أربع قطرات من المعالجة المسبقة ، وثلاث غطيها بالبرفيل واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين بعد الغسيل ثلاث إلى خمس مرات في الماء المقطر.
كما كان من قبل ، أضف أربع قطرات من مجموعة مسبار DAP B للتحكم في شرائح الدماغ لتقييم تلطيخ الخلفية وأربع قطرات من مسبار الاستهداف في الأقسام التجريبية. ضع زوج الشرائح المغطاة بالفيلم في صندوق الشرائح واحتضنه لمدة ساعتين عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين. بعد اتباع الخطوات الواردة في البروتوكول المكتوب لتطوير إشارة DAB لل mRNA محل الاهتمام ، تحقق من وجود إشارة تحت مجهر المجال الساطع.
تحديد المناطق المرجعية في عينات الدماغ لمراقبة وجود النقاط طوال عملية البقع المضادة. لمواجهة البقع. ضع الشرائح أولا باللون الأزرق السريع الفاخر المسخن مسبقا إلى 60 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
بعد الحضانة ، اشطف الشرائح عدة مرات في الماء المقطر ثم اغمس الشرائح في محلول كربونات الليثيوم 0.05٪ عدة مرات لبدء التمايز. بعد ذلك ، اغمس الشرائح مرتين في الإيثانول الطازج بنسبة 75٪ واشطفها في الماء المقطر. افحص شرائح الدماغ تحت مجهر المجال الساطع.
لاحظ أن المادة الرمادية والبيضاء يجب أن تبدأ في التمييز ، ولا تزال حبيبات الحمض النووي الريبي مرئية على شكل نقطة زرقاء داكنة وسوداء. تحقق من أن المحاور تبدأ في الظهور كألياف زرقاء فاتحة ، كرر إجراء التلوين الأزرق الفاخر ، واحتضان اللون الأزرق الفاخر في خطوات من 10 إلى 20 دقيقة ، ومراقبة البقعة المضادة بعناية ووجود حبيبات الحمض النووي الريبي عند تحقيق التلوين الأمثل. ضعي شرائح الشطف في محلول البنفسجي الكريستال واحتضنها لمدة 10 دقائق بعد الحضانة.
شطف الشرائح في الماء المقطر. اغمس الشرائح في 70٪ من الإيثانول من خمس إلى 10 مرات ثم قم بتجفيف التجفيف من خلال ثلاثة تغييرات سريعة بنسبة 100٪ من الإيثانول في غطاء الدخان. امسح شرائح الدماغ عن طريق الحضانة مرتين في الزيلين.
عامل مقاصة بديل لمدة دقيقتين ومرة ثالثة لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتركيب شرائح الدماغ في وسط تركيب دائم قائم على الزيلين وقم بتحليله تحت مجهر المجال الساطع. تم إجراء الأسماك باستخدام كشف القناع الناجم عن البروتياز متبوعا بالكشف عن الأجسام المضادة لترانسفيراز أسيتيل الكولين المبين باللون الأحمر.
فشل الجسم المضاد في التعرف على الدردشة عند إجراء العلاج بالبروتياز. يتم عرض أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مسبار غير مستهدف ومسبار الاستهداف الرابع TF باستخدام نفس إعدادات المجهر وتعديلات الصورة. يشار إلى أربع حبيبات موجبة خضراء ATF مع توطين محوري غير واضح بعلامات استفهام.
المناطق الزرقاء عبارة عن نوى ملطخة عندما تم إجراء الأسماك باستخدام مستضد ناتج عن الحرارة. كان الكشف عن تلطيخ الدردشة المناعي الفلوري الموضح مرة أخرى باللون الأحمر ناجحا. تظهر أربع حبيبات موجبة موضعية في المحاور برتقالية اللون البرتقالي ويتم تمييزها على أنها جيدة بعد محاور عش كانت مضادة للبقعة مع فاخرة.
تم تلطيخ SOTA الأزرق السريع والعصبي باللون البنفسجي اللامكاني دون المستوى الأمثل. يمكن أن ينتج تلطيخ أزرق سريع إذا انخفضت درجة الحرارة. هنا تم تلطيخ العينات باللون الأزرق السريع الفاخر عند 40 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.
يشار إلى أربع حبيبات موجبة مع توطين عرضي غير واضح بعلامات استفهام. يحدث التلوين دون المستوى الأمثل أيضا عندما لا يتم فحص شدة البقعة المضادة بعد فترات حضانة قصيرة كما هو موضح هنا. يتم عرض أمثلة على تلطيخ LFB الأمثل جنبا إلى جنب مع ish باستخدام مسبار غير مستهدف أو مسبار استهداف TF رباعي هنا.
تم ضبط الحصول على الصورة تلقائيا للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء. تم وضع علامة Axon المترجمة على TF ، وأربعة حبيبات على أنها على ما يرام. بمجرد إتقانها.
يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يوم إلى ثلاثة أيام اعتمادا على طريقة البقع المضادة المختارة بعد تطويرها. تمهد هذه التقنية لعلماء الأعصاب لاستكشاف ترجمة mRNA وتوطينه في فارق بسيط.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تظهر هذه الدراسة استخدام تهجين الحمض النووي الريبي الموضعي (ISH) جنبًا إلى جنب مع الكيمياء النسيجية المناعية لتصور الحمض النووي الريبي المرسال في محاور الأنسجة الدماغية للفأر والإنسان. تتيح هذه الطريقة اكتشاف الحمض النووي الريبي المرسال الموضعي، مما يوفر رؤى حول دورها في علم الأعصاب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا الجزيئية
- تعبير الجينات
الخلفية
- تهجين الحمض النووي الريبي الموضعي (ISH) هي تقنية لتصور الحمض النووي الريبي داخل الخلايا.
- فهم توطين الحمض النووي الريبي المرسال ضروري لدراسة تعبير الجينات في الدماغ.
- يعزز الجمع بين ISH والكيمياء النسيجية المناعية قدرات الكشف.
- يمكن لهذا النهج الكشف عن التوزيع المكاني للحمض النووي الريبي المرسال في الأنسجة العصبية.
هدف الدراسة
- للكشف عن الحمض النووي الريبي المرسال الموضعي في محاور في عينات الدماغ.
- لدراسة العلاقة بين توطين الحمض النووي الريبي المرسال والترجمة في الخلايا العصبية.
- للتحقق من فعالية إجراءات كشف مختلفة وأساليب التلطيخ.
الطرق المستخدمة
- معالجة العينة بما في ذلك الغلي والخضوع للإنزيمات البروتيازية.
- تهجين مسبار الحمض النووي الريبي المستهدف للحمض النووي الريبي المرسال.
- خطوات التضخيم والكشف للتصور.
- تلطيخ المحاور بالأجسام المضادة أو الأصباغ للتحقق.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لـ TF four mRNA في عينات الدماغ.
- تظهر إجراءات كشف مختلفة نتائج متسقة.
- تأكيد توطين الحمض النووي الريبي المرسال إلى المحاور من خلال تحليلات المجهر.
- رؤى حول ترجمة الحمض النووي الريبي المرسال الموضعي في الدماغ.
الاستنتاجات
- الطريقة المدمجة بين ISH والكيمياء النسيجية المناعية فعالة لدراسة توطين الحمض النووي الريبي المرسال.
- يمكن لهذا النهج المساعدة في الإجابة على أسئلة حاسمة في علم الأعصاب.
- يمكن للبحوث الإضافية توسيع فهم ديناميكيات الحمض النووي الريبي المرسال في الأنسجة العصبية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Understanding subcellular mRNA localization in axons provides mechanistic insights into neuronal function, supporting target validation in neurodegenerative disease models. This technique enables direct visualization of low-abundance transcripts in complex tissues, reducing reliance on artificial culture systems. It enhances predictive confidence in preclinical target de-risking by confirming spatial gene expression patterns relevant to axon pathfinding, repair, and neurodegeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming axonal mRNA recruitment in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target transcript localization.
- Predictive Value: Strengthens target confidence by linking mRNA localization to axonal function in mature brain tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing mRNA-axon colocalization.
- Quantitative Output: Provides puncta-based readouts amenable to image analysis for screening applications.
- Platform Reuse: Compatible with multiple counterstains (immunohistochemistry, histological dyes) enabling adaptability across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to models of neurodegeneration where axonal mRNA localization and local translation are implicated.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by verifying mRNA localization in human and mouse brain sections.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming subcellular RNA distribution prior to functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for neuroscience targets involving axonal biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining which mRNAs are localized to axons in intact tissue.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible detection of RNA puncta in axonal compartments.
- Analytics: Generates spatial and quantitative mRNA readouts that help compare experimental conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo relevance by validating localization in mammalian brain sections.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable capability for multiple targets beyond Atf4, supporting broad neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around mRNA function.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through standardized unmasking, hybridization, and detection steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in axons.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed subcellular mRNA localization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, immunohistochemistry, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to RNAscope ISH reagents, hybridization ovens, and antigen retrieval systems.
- Necessitates standardization across teams for probe design, unmasking conditions, and counterstain optimization.
- Must account for tissue-specific variability in antigen retrieval efficiency between mouse and human samples.
- Limited by the need for optimized counterstaining to avoid obscuring RNA puncta signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Heat-Induced Antigen/RNA Unmasking
2:21
Probe Hybridization
4:01
Immunofluorescence Staining
5:42
Diaminobenzidine (DAB)-based Chromogenic ISH Assay Followed by Luxol Fast Blue and Cresyl Violet Stain Using Heat-induced and Protease-induced RNA Unmasking
8:54
Results: Aft4 Localization to Cholinergic Axons in the Mouse Dentate Gyrus and Myelinated Axons in the Adult Hippocampal Formation
10:53
Conclusion
