الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة في الموقع التهجين

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف mRNAs الموضعية عن طريق الخطأ في عينات الدماغ البالغة. يتم تحقيق ذلك عن طريق المعالجة المسبقة. يتم إجراء العينات عن طريق الغليان وهضم البروتياز لكشف القناع عن جزيئات الرنا المرسال كخطوة ثانية يتم إجراء التهجين ، تليها خطوات التضخيم والكشف ، والتي تتيح تصور الرنا المرسال محل الاهتمام.

يتم تلطيخ المحاور التالية بالأجسام المضادة أو الأصباغ من أجل التحقق من أن mRNA محل الاهتمام في المحاور. تظهر النتائج وجود TF أربعة mRNA في عينات الدماغ باستخدام إجراءات وعدادات مختلفة للكشف ، وطرق تلطيخ تعتمد على تحليلات الفحص المجهري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة في علم الأعصاب مثل mRNAs التي يتم توطينها وترجمتها بدون exons.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتخليق البروتين داخل المكونات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل التشعبات والخلايا والأنسجة غير العصبية التي يحدث فيها توطين الرنا المرسال. بعد تثبيت شرائح الدماغ ، وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب ، قم بإعداد جرة كوبين تحتوي على 60 مل من محلول استرجاع المستضد واغمر الشرائح في المحلول. بعد ذلك ، املأ دورق سعة لتر واحد بالماء المقطر وضعه في الميكروويف لتخفيف الحرارة.

عند إجراء الكشف عن القناع ، ضع البرطمان المشترك الذي يحتوي على الشرائح ومحلول الاسترجاع في الميكروويف. اغلي الشرائح بقوة عالية لمدة خمس دقائق. مباشرة بعد توقف المحلول عن الغليان ، قم بتسخين الشرائح مرة أخرى بقوة عالية لمدة خمس دقائق إضافية.

اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة بعد التبريد ، اغمر الشرائح في طبق يحتوي على PBS لغسلها ثم كرر الغسيل مرتين أخريين بعد الغسيل ، ضع الشرائح على سطح مستو وأضف قطرتين إلى ثلاث قطرات أو 100 ميكرولتر من DAP B.Probe إلى قسمين أو ثلاثة أقسام للدماغ كعنصر تحكم. لتقييم تلطيخ الخلفية ، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من مسبار الاستهداف إلى الأقسام التجريبية للكشف عن الحمض النووي الريبي محل الاهتمام ، يتم استخدام مسبار يستهدف بقايا 20 إلى 1381 من الفأر TF أربعة RNA هنا. استخدم الملقط لوضع المعلمة فوق الشرائح لتجنب تبخر المسبار.

ثم ضع الشرائح في صندوق الشرائح المرطب داخل فرن التهجين واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد انقضاء وقت الحضانة ، اغسل الشرائح في طبق مع مخزن مؤقت للغسيل لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من كاشف التضخيم MP واحد fl إلى كل شريحة دماغية.

ثم قم بتغطيتها بفيلم بارا فيلم جديد في صندوق الشرائح واحتضانها على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في فرن التهجين. بعد غسل الشرائح كما كان من قبل ، أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات من كاشف التضخيم A MP four fl إلى كل شريحة من الدماغ وقم بتغطيتها بالبيرفيل. احتضن الشرائح في صندوق الشرائح عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في فرن التهجين.

اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن غسيل واحد لمدة دقيقتين لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. كما كان من قبل بعد الغسيل الأخير ، قم بتغطية كل شريحة ب 100 إلى 200 ميكرولتر من محلول المانع الذي يحتوي على ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر BSA 100 ملليمولار جلايسين و 0.25٪ تريتون × 100 في PBS ، قم بتغطية كل شريحة مع الطفيلي واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف في محلول مانع إلى الشرائح. يتم استخدام الجسم المضاد للكولين أسيتيل ترانسفيراز هنا بعد تغطية الشرائح مع perfil incubate لمدة يومين عند أربع درجات مئوية.

تأكد من عدم جفاف شرائح الدماغ إذا لزم الأمر ، أعد وضع محلول الأجسام المضادة ل CHATT على شرائح الدماغ بعد 24 ساعة من الحضانة. بعد غسل الشرائح ثلاث مرات في XPBS واحد لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المترافق المناسب من Alexa إلى الشرائح.

قم بتغطيتها بالبارم واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بينما تكون محمية من الضوء بعد انقضاء الساعة. اغسل الشرائح ثلاث مرات في XPBS لمدة خمس دقائق لكل منها كما كان من قبل ، ثم اغسلها مرة واحدة بالماء المقطر. قم بتركيب الشرائح بوسيط تركيب يحتوي على DPI ثم تصور شرائح الدماغ تحت المجهر الفلوري.

بعد تحضير عينات الدماغ البشري المدمجة في البارافين الرسمية والثابتة ، وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول ، قم بإجراء كشف المستضد الناجم عن الحرارة عن طريق غمر الشرائح في محلول معالج مسبق ساخن وغليها لمدة 15 دقيقة. بعد الغسيل ثلاث إلى خمس مرات في الماء المقطر وثلاث إلى خمس مرات في الإيثانول الطازج بنسبة 100٪ ، اترك الشرائح تجف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإجراء كشف المستضد الناجم عن البروتياز. أضف أربع قطرات من المعالجة المسبقة ، وثلاث غطيها بالبرفيل واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين بعد الغسيل ثلاث إلى خمس مرات في الماء المقطر.

كما كان من قبل ، أضف أربع قطرات من مجموعة مسبار DAP B للتحكم في شرائح الدماغ لتقييم تلطيخ الخلفية وأربع قطرات من مسبار الاستهداف في الأقسام التجريبية. ضع زوج الشرائح المغطاة بالفيلم في صندوق الشرائح واحتضنه لمدة ساعتين عند 40 درجة مئوية في فرن التهجين. بعد اتباع الخطوات الواردة في البروتوكول المكتوب لتطوير إشارة DAB لل mRNA محل الاهتمام ، تحقق من وجود إشارة تحت مجهر المجال الساطع.

تحديد المناطق المرجعية في عينات الدماغ لمراقبة وجود النقاط طوال عملية البقع المضادة. لمواجهة البقع. ضع الشرائح أولا باللون الأزرق السريع الفاخر المسخن مسبقا إلى 60 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، اشطف الشرائح عدة مرات في الماء المقطر ثم اغمس الشرائح في محلول كربونات الليثيوم 0.05٪ عدة مرات لبدء التمايز. بعد ذلك ، اغمس الشرائح مرتين في الإيثانول الطازج بنسبة 75٪ واشطفها في الماء المقطر. افحص شرائح الدماغ تحت مجهر المجال الساطع.

لاحظ أن المادة الرمادية والبيضاء يجب أن تبدأ في التمييز ، ولا تزال حبيبات الحمض النووي الريبي مرئية على شكل نقطة زرقاء داكنة وسوداء. تحقق من أن المحاور تبدأ في الظهور كألياف زرقاء فاتحة ، كرر إجراء التلوين الأزرق الفاخر ، واحتضان اللون الأزرق الفاخر في خطوات من 10 إلى 20 دقيقة ، ومراقبة البقعة المضادة بعناية ووجود حبيبات الحمض النووي الريبي عند تحقيق التلوين الأمثل. ضعي شرائح الشطف في محلول البنفسجي الكريستال واحتضنها لمدة 10 دقائق بعد الحضانة.

شطف الشرائح في الماء المقطر. اغمس الشرائح في 70٪ من الإيثانول من خمس إلى 10 مرات ثم قم بتجفيف التجفيف من خلال ثلاثة تغييرات سريعة بنسبة 100٪ من الإيثانول في غطاء الدخان. امسح شرائح الدماغ عن طريق الحضانة مرتين في الزيلين.

عامل مقاصة بديل لمدة دقيقتين ومرة ثالثة لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتركيب شرائح الدماغ في وسط تركيب دائم قائم على الزيلين وقم بتحليله تحت مجهر المجال الساطع. تم إجراء الأسماك باستخدام كشف القناع الناجم عن البروتياز متبوعا بالكشف عن الأجسام المضادة لترانسفيراز أسيتيل الكولين المبين باللون الأحمر.

فشل الجسم المضاد في التعرف على الدردشة عند إجراء العلاج بالبروتياز. يتم عرض أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مسبار غير مستهدف ومسبار الاستهداف الرابع TF باستخدام نفس إعدادات المجهر وتعديلات الصورة. يشار إلى أربع حبيبات موجبة خضراء ATF مع توطين محوري غير واضح بعلامات استفهام.

المناطق الزرقاء عبارة عن نوى ملطخة عندما تم إجراء الأسماك باستخدام مستضد ناتج عن الحرارة. كان الكشف عن تلطيخ الدردشة المناعي الفلوري الموضح مرة أخرى باللون الأحمر ناجحا. تظهر أربع حبيبات موجبة موضعية في المحاور برتقالية اللون البرتقالي ويتم تمييزها على أنها جيدة بعد محاور عش كانت مضادة للبقعة مع فاخرة.

تم تلطيخ SOTA الأزرق السريع والعصبي باللون البنفسجي اللامكاني دون المستوى الأمثل. يمكن أن ينتج تلطيخ أزرق سريع إذا انخفضت درجة الحرارة. هنا تم تلطيخ العينات باللون الأزرق السريع الفاخر عند 40 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

يشار إلى أربع حبيبات موجبة مع توطين عرضي غير واضح بعلامات استفهام. يحدث التلوين دون المستوى الأمثل أيضا عندما لا يتم فحص شدة البقعة المضادة بعد فترات حضانة قصيرة كما هو موضح هنا. يتم عرض أمثلة على تلطيخ LFB الأمثل جنبا إلى جنب مع ish باستخدام مسبار غير مستهدف أو مسبار استهداف TF رباعي هنا.

تم ضبط الحصول على الصورة تلقائيا للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء. تم وضع علامة Axon المترجمة على TF ، وأربعة حبيبات على أنها على ما يرام. بمجرد إتقانها.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يوم إلى ثلاثة أيام اعتمادا على طريقة البقع المضادة المختارة بعد تطويرها. تمهد هذه التقنية لعلماء الأعصاب لاستكشاف ترجمة mRNA وتوطينه في فارق بسيط.