عزل وتوصيف الخلايا الأقمار الصناعية من عضلات الفئران رئيس قسيمي خيشومي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الساتلية عن العضلات التمثيلية التي تنشأ من الأقواس العضدية الأولى والثانية والرابعة لثقافتها على مصفوفة خارج الخلية. بقع جل. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح المذبحة أولا ، عضلات المعدة والليفادا الحنكي لفأر شاب بالغ.

في الخطوة الثانية ، يتم عزل الخلايا الساتلية من كل عينة عضلية عن طريق الأنزيم والهضم والمدة. ثم يتم زراعة الخلايا على المواد الهلامية خارج الخلية. في النهاية ، يمكن تتبع الحالة الديناميكية لتكوين العضلات لمزارع الخلايا الساتلية من خلال تلطيخ علامات العضلات ذات الأهمية.

الشفة المشقوقة والحنك المشقوق هي واحدة من أكثر التشوهات القحفية الوجهية شيوعا لدى البشر. عند وجود شق ، يلزم إجراء إصلاح جراحي من أجل إغلاق العيب والسماح بتطور الكلام الطبيعي والتليف وتجديد العضلات المعيب ، ومع ذلك ، يمكن أن يعيق الانتعاش الوظيفي لعضلات الحنك الرخوة. بعد إصلاح الحنك المشقوق ، يمكنك إثبات طريقة مبتكرة لثقافة الخلايا الساتلية المعزولة حديثا باستخدام طلاء بقعة هلام المصفوفة الخلوية الخارجية بحجم المليمتر فقط.

هذا يتجنب شرط التوسع. وقبل يوم واحد من العزلة ، ضع ثماني غرف بئر تنزلق في طبق بتري 100 ملم وانقل الطبق إلى سطح بارد. بعد 10 دقائق، استخدم ماصة دقيقة مملوءة مسبقا لتوزيع قطرة واحدة سعة 10 ميكرولتر من هلام المصفوفة خارج الخلية في كل بئر.

بعد تبريد الشرائح لمدة سبع دقائق أخرى ، قم بإزالة الجل المتبقي تماما وجفف الآبار عند 37 درجة مئوية طوال الليل في اليوم التالي. لتشريح عضلة المذبحة ، قم بإزالة الجلد من رأس فأر يبلغ من العمر تسعة أسابيع واستخدم إبر تحت الجلد لتثبيت الرأس على جانبه. على وسادة سيليكون ، اعزل الغدة النكفية والعصب الوجهي وإزالة الغدة.

بعد ذلك ، باستخدام شفرة مشرط رقم 15 ، قم بإزالة العصب الوجهي بعناية. تحديد الرأس السطحي لعضلة المضغة. بعد ذلك ، استخدم ملقطا مستقيما لفصل الوتر عن أصله في العملية الوجانية ، متبوعا بقطع دقيق للوتر بمقص تشريح.

باستخدام المشرط ، قم بتشريح الرأس السطحي للمذبحة حتى يتم إدخاله في الزاوية والنصف السفلي من السطح الجانبي لراموس الفك السفلي. لتشريح البطن الخلفي للعضلة ثنائية المعدة ، قم بتثبيت الرأس في وضع ضعيف بالإبر وإزالة الدهون تحت الجلد التي تغطي كل من الغدد تحت اللسان وتحت الفك السفلي. كشف بطون عضلات المعدة الأمامية والخلفية ثم أمسك الوتر الأمامي للبطن الخلفي بملقط مستقيم مقطوع بعناية تشريح الوتر إلى أصله في الطبلة البولر.

لتشريح عضلة ليفادا فلي بالاتينو ، قم بتوطين عضلة الإبرة الهاليدية. اسحبه بشكل جانبي وقم بإزالة الأنسجة العضلية بعناية. بعد ذلك ، قم بتوطين وتر levada vli palatino الذي يدخل هذا الثير الطبلي وقم بتشريحه بعناية.

ثم ارفع المريء من خلف القصبة الهوائية. حدد منطقة الحنك الرخو حيث يتم إدخال حنك ليفادا فلي وقطع العضلات. ثم اغمر العضلات في 70٪ من الإيثانول ونقلها إلى PBS المثلج المكمل بالمضادات الحيوية.

لعزل الخلايا الساتلية ، انقل كل عضلة إلى آبار فردية من ستة ألواح آبار ، وقم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة بحجم ملليمترين. الحرص على عدم فرم العضلات كثيرا. بعد ذلك ، قم باحتضان شظايا الأنسجة بعناية في 2.5 مل من محلول بروناز 0.1٪ لكل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة مع رج لطيف كل 20 دقيقة.

عندما تظهر حزم الألياف مظهر خفف عند 2.5 ملليلتر من DMEM مكمل بمصل الحصان والمضادات الحيوية لكل بئر ونقل الأنسجة المهضومة إلى أنابيب مخروطية فردية 15 ملليلترا. قم بتدوير ملاط الأنسجة وصب المواد الطافية. ثم أضف خمسة ملليلتر من الوسط إلى كل أنبوب وقم بتجانس الأنسجة بماصة بلاستيكية سعة 10 مل.

قم بتدوير الأنسجة مرة أخرى ونقل المواد الطفية إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 15 ملليلترا. ثم أضف خمسة ملليلتر أخرى من الوسط إلى الأنابيب وقم بتصنيف قطع الأنسجة مرة أخرى حتى تمر الشظايا بسهولة عبر الماصة. بعد طرد مركزي آخر ، اسحب المواد الطافية إلى الأنابيب المقابلة المناسبة وقم بتصفية معلقات الخلية من خلال مصافي 40 ميكرومتر في أنابيب فردية سعة 50 ملليلترا.

اغسل المصافي بملليلتر واحد من DMEM لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلايا. ثم قم بتدوير الخلايا ، وأعد تعليق الكريات في شكل جديد ومتوسط ، وعد الخلايا لزراعة الخلايا الساتلية المعزولة. بعد ذلك ، قم بتخفيف معلقات الخلية إلى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا الثلاث لكل 10 ميكرولتر من وسط الزراعة.

ثم أضف 10 ميكرولترات من الخلايا إلى كل بقعة هلامية مصفوفة خارج الخلية معدة مسبقا ، واحتضن المواد الهلامية عند 37 درجة مئوية بعد ست ساعات. أضف بعناية 400 ميكرولتر من وسط الثقافة إلى كل بقعة هلامية وأعد الشرائح إلى الحاضنة. بعد ثلاثة أيام ، ابدأ في تمايز الخلايا بإضافة وسط الثقافة المناسب مباشرة بعد العزل.

أكثر من 90٪ من الخلايا الساتلية المعزولة حديثا تعبر عن الحزمة السابعة بحلول اليوم الرابع ، يتم التعبير عن الحزمة السابعة و MyoD بواسطة الخلايا الساتلية من جميع مجموعات العضلات. يتم التعبير عن OG الخاص بي بشكل كبير في اليوم السابع في جميع مجموعات العضلات. بعد أربعة أيام من البذر على المصفوفة خارج الخلية ، بقع الهلام ، تبدأ الخلايا المتكاثرة في الاندماج وتشكيل أنابيب عضلية صغيرة متعددة النوى ، والتي تعبر عن سلسلة الميوسين الثقيلة في اليومين السابع والعاشر.

أنابيب myo الطويلة والمنظمة جيدا بحلول اليوم 10. يمكن أيضا ملاحظة ارتعاش أنبوب Myo. يسمح هذا البروتوكول بدراسة الخلايا الساتلية التي تنشأ من عضلات رأس برير ويوفر إمكانيات جديدة لعلاج البال المشقوق. المرضي.