فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الخلايا العصبية المهاجرة في شرائح الدماغ الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح المخيخ أولا من فأر P 10. الخطوات التالية هي تحضير شرائح المخيخ الحادة وتسمية الخلايا العصبية بمسبار الفلورسنت.

ثم يتم إجراء تجربة الفاصل الزمني من خلال التصوير متحد البؤر الكلي أو الفحص المجهري متحد البؤر. الخطوة الأخيرة هي تتبع الخلايا العصبية في الأفلام الناتجة. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري خارج الجسم الحي لإظهار دور العوامل الذاتية أو المواد السامة التي تنظم هجرة الخلايا العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، هي أن التصوير متحد البؤر الكلي يزيد من الشعور برؤية ترك شرائح الفن الدماغي الموضوعة مباشرة على إدخال الفخذ. أولا ، خطرت لي فكرة هذه الطريقة عندما واجهت صعوبات في نقل وتثبيت شرائح الفن الدماغي لتجارب الفحص المجهري متحد البؤر ابدأ بالوصول إلى جمجمة رأس جرو فأر P 10 مقطوع الرأس ، باستخدام مقص القزحية الناعم ، قم بعمل شقين جانبيين بدقة من القاعدة إلى المنطقة المنقارية للجمجمة. ثم قم بإزالة الجمجمة المقطعة باستخدام ملقطين رقم ثلاثة ، مما يؤدي إلى كسر أي التصاق بين الدماغ والجمجمة.

الآن ، أخرج الدماغ بنهاية الملعقة من ملعقة ، وضعه في طبق بتري 35 ملم مع ملليلترين من HBSS البارد على الثلج. الآن ، تحت المجهر المجسم ، اعزل المخيخ عن الدماغ عن طريق تمزقات D باستخدام ملقطين رقم ثلاثة. يسكب المخيخ في طبق جديد مع عازلة مثلجة باردة.

ثم باستخدام نفس الأدوات ، قم بإزالة والتخلص من الحبل الشوكي المتبقي وغشاء التقشير. قم بإعداد مقبض مشرط صلب رقم ثلاثة بشفرة جراحية رقم 15. باستخدام الشفرة تحت مجهر استريو ، قم بقطع المخيخ بين الأوجه ونصف الكرة الأيمن.

الآن عند الاهتزاز ، ضع قطرة من غراء السيانوكريليت على قرص العينة وانتظر من 15 إلى 25 ثانية حتى يتبدد بخار المذيب قبل نقل المخيخ إلى القرص. بعد ذلك ، قم بتثبيت حافة المخيخ على قرص العينة وانتظر 10 ثوان. الآن باستخدام المناور ، أدخل قرص العينة في الدرج العازل بحيث يكون المحور العرضي للمخيخ عموديا على حامل السكين.

تأكد من تأمين القرص باستخدام مفتاح ربط الشب. ثم قم بتغطية المخيخ بعناية باستخدام HBSS وقم بتحميل الثلج المجروش في حمام التبريد. لتقطيع العينة ، ضع شفرة نظيفة ، بحيث تكون حافتها خلف الحافة الخلفية للعينة مباشرة.

حدد هذا على أنه نقطة البداية للتزيين. ثم استخدم الأمر forward لتعريف نقطة النهاية على أنها بعد الحافة الأمامية للعينة. الآن اضبط سمك الشريحة على 180 ميكرون.

ثم اضبط سرعة التقسيم على 2.5 والتردد على ثمانية ، وابدأ في تقسيم العينة. اجمع ما يصل إلى خمس شرائح لكل مخيخ. التقط كل قسم باستخدام ماصة زجاجية عريضة مقطوعة.

انقل الأقسام إلى طبق يحتوي على HBSS بارد على الثلج. بعد جمع الشرائح تحت مجهر استريو ، قم بإزالة السحايا بعناية باستخدام ملقطين رقم خمسة. أيضا ، افصل LOEs برفق لتحميل المسبار بشكل أفضل.

بعد تقطيع العينة إلى شرائح ، استخدم ماصة خنزير عريضة مقطوعة لنقلها مع بعض HBSS إلى ستة ألواح بئر تصل إلى ثلاث شرائح في كل بئر. بعد ذلك ، بعد إفراغ الوسائط في كل محملة ، أضف جيدا خمسة ملليلتر من محلول التحميل الذي يحتوي على 10 ميكرومولار من صبغة الفلورسنت لحماية العينات من الضوء ، وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم. ثم ضع اللوحة على مطفرة مضبوطة على 35 دورة في الدقيقة.

دع اللوحة تحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للصبغة بتسمية آبار الخلايا. الآن انقل الشرائح كما كان من قبل إلى غشاء ملحق transwell الذي يحتوي على ثلاثة مسام ميكرون. ثم استنشق وسط التحميل ، مع ترك الشرائح فقط.

الآن قم بإزالة الملحق والشرائح لملء البئر ب 1.9 مل من DMEM. ثم ضع الملحق مرة أخرى وأضف 100 ميكرولتر أخرى من DMEM لتغطية الأنسجة. احتضان هذا المستحضر لمدة ساعتين وبعد ذلك ستكون الخلايا الحبيبية مرئية.

انقل اللوحة بدون غطاء إلى غرفة بيئية ذات تدفق غاز مستمر على مجهر متحد البؤر. ثم ضع الغطاء الزجاجي على ملحق اللوحة في المجهر متحد البؤر لإجراء تجارب الفاصل الزمني. دع الخلايا تحتضن في الغرفة لمدة ساعتين إضافيتين قبل المتابعة.

لتصور الخلايا الحبيبية المهاجرة في شرائح الأنسجة ، قم بإضاءة المستحضر بضوء 488 نانومتر واستخدم هدفا جافا مرتين. اكتشف انبعاثات الفلورسنت من 500 إلى 530 نانومتر باستخدام الصورة J.لكل صورة لفيلم اللقطات المتتابعة، قم بإجراء إسقاط Zack باستخدام وضع الانحراف المعياري، واضبط التباين ومستويات السطوع لكل صورة بحيث يسهل رؤية الخلايا الحبيبية المصنفة. الآن ، اختر المكون الإضافي للتتبع اليدوي من قائمة تحليل الجسيمات.

استخدم المكون الإضافي للنقر على النقطة المركزية لكل جسم خلية مسمى طوال تسلسل صورة الفاصل الزمني. ثم قم بتصدير بيانات التتبع الأولية إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل. أعد تنظيم بيانات التتبع الأولية المصدرة من الصورة J باستخدام أداة ذكية محلية الصنع تحدد كل خلية والمواضع المرتبطة بها باستخدام البرنامج.

احسب إجمالي مسافة السفر ومتوسط سرعة الترحيل لكل خلية. في المخيخ المبكر بعد الولادة ، تظهر الخلايا الحبيبية تغييرات كبيرة في طريقة هجرتها وسرعة هجرتها أثناء عبورها طبقات قشرية مختلفة. تم فحص الخلايا الحبيبية المسماة CTG في شرائح الأنسجة المخيخية للفئران PM.

كما هو موضح ، هاجرت الخلايا الحبيبية شعاعيا في الطبقة الجزيئية بمتوسط سرعة 18 ميكرون في الساعة. ثم تم استخدام مستحضر آخر لاختبار تأثير الأدوية التي يتوقع أن تغير معدل الهجرة. أدى تطبيق الحد الأقصى للأجور 38 على وسط الاستزراع إلى انخفاض سرعة الخلايا الحبيبية بنسبة 79٪ في الطبقة الجزيئية ، بانخفاض إلى 2.5 ميكرون في الساعة.

أدى إعطاء PI one ، وهو مثبط ل TPA الداخلي ، إلى تقليل سرعة هجرة الخلايا الحبيبية بنسبة 78٪ من سرعة التحكم إلى 4.2 ميكرون في الساعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تتبع الخلايا في بالون النظرية النامي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توفير معايير بيئية مناسبة وثابتة ضرورية لهجرة الخلايا بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علوم الأعصاب لاستكشاف العمليات الواقعية في الدماغ.