التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة
مايو 14, 2015
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام طريقة أحادية الطبقة الخالية من المصل. يمكن استخدام هذه الأسلاف لاشتقاق أنواع الخلايا العصبية الناضجة أو لدراسة عملية المواصفات العصبية وهي قابلة لتحجيم تنسيق متعدد الآبار للفحص المركب.
الهدف العام من هذا الإجراء هو التفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية للفأر إلى سلالة عصبية في مزرعة خلايا أحادية الطبقة خالية من المصل. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء وعاء الاستزراع أولا بالجيلاتين. في الخطوة الثانية ، ترتبط الخلايا الجذعية الجنينية بتعليق خلية واحدة في وسط التمايز ويتم تخفيفها إلى كثافات الطلاء المناسبة.
في الخطوة الأخيرة ، يتم زرع الخلايا على صفيحة ENC المطلية بالهلام. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي الفلوري لتأكيد نجاح التمايز عن طريق تصور العلامات العصبية ذات الأهمية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الطلاء بالكثافة المناسبة أمر بالغ الأهمية لتحقيق تمايز جيد.
وهناك العديد من العوامل التي تؤثر على كثافة الطلاء بشكل مباشر وغير مباشر. قبل الطلاء ، تقوم الخلايا بتسخين كمية من الجيلاتين بنسبة 1٪ في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تذوب. ثم امزج الجيلاتين مع 500 مل من PBS الدافئ وقم بتغطية قاع حاوية زراعة الخلية بما يكفي من المحلول لتغطية السطح أثناء طلاء الجيلاتين.
اشطف المزرعة الفرعية للخلايا الجذعية للفأر مرتين في PBS. ثم أضف ملليلتر واحد من كاشف التفكك إلى الثقافة. بعد دقيقتين إلى خمس دقائق ، اضغط على الوعاء لإخراج الطبقة الأحادية في معلق خلية واحدة وجمع المزرعة في ما مجموعه 10 ملليلتر من كاشف تفكك الخلية والمتوسطة.
انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بتدويرها في جهاز طرد مركزي. ثم بعد الشفط الدقيق للسوبينات ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من التدفئة المسبقة N two B 27 عن طريق تأليب جانب الأنبوب. لتجنب تكوين فقاعات ، عد الآن الخلايا التي تسجل التركيز وأعد تعليقها عند العدد المناسب من الخلايا لكل وحدة حجم لكل بئر في التدفئة المسبقة N اثنين B 27 وفقا للجدول.
ثم استنشق الجيلاتين من وعاء الاستزراع وقم بوضع الخلايا دون تحريك الحاوية. ضع المزارع في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استبدال الوسيط كل يوم إلى يومين.
مع N two B 27 الطازج ، ستبدأ الخلايا في التمايز وإظهار الجوارب ، تعبير واحد في غضون أربعة إلى ستة أيام لتلطيخ الخلايا للتصوير المناعي الفلوري. قم بإزالة وسط التمايز من الثقافات وقم بتثبيت الخلايا في 500 ميكرولتر من 4٪ بارا فورمالديهايد بعد 15 دقيقة ، وغسل الخلايا وتغلغلها مرتين باستخدام ملليلترين من PBS مع المراهقين. ثم قم بحظر أي ارتباط غير محدد بحضانة الخلايا لمدة ساعة واحدة.
في مليلتر واحد من توين PBS مكمل بمصل على لوحة هزاز بعد غسل الخلايا كما هو موضح للتو. عند 500 ميكرولتر من IgG للفأر مقابل بيتا ثلاثة توبولين للثقافات من أجل حضانة ليلية على لوحة الروك عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي.
بعد غسل الخلايا ، احتضان العينات في جسم مضاد ثانوي مضاد ل IgG أمريكي يحمل علامات فلورية في درجة حرارة الغرفة المحمي من الضوء مع التأرجح بعد ساعة واحدة. اشطف الخلايا مرة أخرى وصخها في 500 ميكرولتر من DPI لمدة خمس دقائق. أخيرا ، بعد غسل الخلايا للمرة الأخيرة ، قم بتخزينها في PBS tween لمدة تصل إلى أسبوعين عند أربع درجات مئوية.
حتى التصوير. في هذه التجربة ، تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأر مع SOX واحد GFP الداخلي لتتبع التمايز العصبي. في اليوم السادس ، تم تثبيت الخلايا وتلطيخها من أجل العلامة العصبية بيتا ثلاثة توبولين.
عند الكثافة المثلى ، تمايزت الخلايا إلى أسلاف عصبية وخلايا عصبية ، في حين أدى وضعها بكثافة أعلى إلى انخفاض عدد SOX واحد GFP وبيتا ثلاثة خلايا إيجابية للتوبولين. يؤثر حجم حاوية زراعة الخلية على كثافة الطلاء المثلى أيضا. على سبيل المثال ، تتطلب الخلايا المزروعة في صفيحة 96 بئر كثافة خلية أعلى بحوالي 10 مرات من ذلك.
تم طلاء الخلايا في طبق مزرعة من ستة آبار للوصول إلى كثافة الخلايا المثلى والتقاء. أثناء التمايز ، تغير الخلايا الجذعية الجنينية مورفولوجيتها تدريجيا. على سبيل المثال ، في هذه الصور ، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الخلية والمستعمرة من اليوم الأول إلى السادس بعد اشتعال النيران في كثافة الخلايا المثلى.
في اليوم الرابع ، تبدأ الخلايا في أن تصبح أسلاف عصبية كدليل على ظهور إشارة الفلورسنت الخضراء من مراسل SOX one GFP. وبحلول اليوم السادس ، تكون معظم الخلايا SOX واحدة موجبة على الرغم من توقع وجود بعض الخلايا غير العصبية بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بدء التمايز العصبي للخلايا الجذعية للفأر في ثقافة خلية أحادية الطبقة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يفصل هذا البروتوكول عملية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى سلائف عصبية باستخدام طريقة الطبقة الواحدة الخالية من المصل. يتيح هذا النهج توليد أنواع ناضجة من الخلايا العصبية، وهو مناسب للتوسع في تنسيقات الأطباق متعددة الآبار لغرض فحص المركبات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- أبحاث الخلايا الجذعية
الخلفية العلمية
- يمكن للخلايا الجذعية الجنينية أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
- تعد السلائف العصبية ضرورية لدراسة التطور العصبي.
- يمكن لطرق الزراعة الخالية من المصل أن تعزز إمكانية تكرار النتائج.
- تعتبر كثافة الزرع المناسبة أمراً بالغ الأهمية لنجاح عملية التمايز.
الغرض من الدراسة
- تأسيس طريقة موثوقة لتوليد السلائف العصبية.
- تسهيل دراسة عمليات التخصيص العصبي.
- تمكين الفحص عالي الإنتاجية للمركبات التي تؤثر على التمايز العصبي.
الطرق المستخدمة
- طلاء أوعية الزرع بالجيلاتين.
- تحضير معلق خلوي أحادي من الخلايا الجذعية الجنينية.
- استزراع الخلايا على الأطباق المطلية بالجيلاتين.
- استخدام مجهر التألق المناعي للتأكد من نجاح التمايز.
النتائج الرئيسية
- تمايز ناجح للخلايا الجذعية الجنينية إلى سلفيات عصبية.
- تأكيد التمايز من خلال تصوير المؤشرات العصبية.
- تحديد كثافات الزرع المثلى لتحقيق تمايز فعال.
- تتميز الطريقة بقابليتها للتوسع لاستخدامها في تطبيقات فحص المركبات.
الاستنتاجات
- تعد طريقة الطبقة الأحادية الخالية من المصل فعالة في توليد الخلايا العصبية السلفية.
- يعتبر التألق المناعي تقنية موثوقة لتقييم التمايز.
- يمكن تكييف هذا البروتوكول لمختلف التطبيقات البحثية في مجال العلوم العصبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح هذا البروتوكول توليداً قابلاً للتوسيع للخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفئران في نظام أحادي الطبقة محدد وخالٍ من المصل، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة وتقليل المخاطر الميكانيكية في عملية اكتشاف أدوية العلوم العصبية. توفر هذه الطريقة منصة كمية قابلة للتكرار لتقييم تأثيرات المركبات على التمايز العصبي، مما يسهل تحديد المركبات الرائدة وتعزيز الثقة التنبؤية في مسارات التطوير قبل السريرية. وتسمح قابليتها للتوافق مع خطوط المراسل وتنسيقات الزراعة عالية الكثافة بدمجها في سير عمل الفحص لدراسات تعديل المسارات والارتباط بالهدف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء آليات التحديد العصبي والتحقق الوظيفي من أهداف التطور العصبي من خلال التمايز الموجه.
- القيمة التشغيلية: توفر نظاماً محدداً وخالياً من المصل، مما يقلل من التباين ويعزز قابلية التكرار عبر التجارب والخطوط الخلوية المختلفة.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقييم التغيرات التي تحثها المركبات في إنتاجية السلف العصبي وتعبير المؤشرات، مما يفيد في تحديد مدى الارتباط بالهدف وتعديل المسارات.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد مجموعة متجانسة من الخلايا العصبية السلفية المناسبة لفحص المركبات والتقييم المظهري للتمايز العصبي.
- القيمة التشغيلية: قابلة للتكيف مع تنسيقات الأطباق متعددة الآبار (مثل أطباق 96 بئرًا) مع إمكانية تحسين كثافة الزرع القابلة للتوسع، مما يتيح تطبيقات متوسطة إلى عالية الإنتاجية.
- جاهزية المقايسة: متوافقة مع التألق المناعي، وقياس التدفق الخلوي، والقراءات الجزيئية للتحليل متعدد المعايير لكفاءة التمايز والتعبير عن العلامات.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تسمح بالانتقال من توليد الخلايا العصبية السلفية إلى نضج العصبونات والخلايا الدبقية الوظيفية، مما يدعم النمذجة ذات الصلة بالأمراض.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تسهل دراسة تحديد السلالة وديناميكيات التمايز باستخدام خطوط مراسلة (مثل SOX1-GFP) لمراقبة التخصيص العصبي في الوقت الفعلي.
- الفائدة قبل السريرية: تمكّن من تقييم تأثيرات المركبات على النضج العصبي والتمايز الدبقي، مما يدعم دراسات علم الصيدلة الخاص بالسلامة ودراسات آلية العمل.
تكامل سير العمل ومسار المعالجة
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشافات المبكرة، حيث تدعم عملية التحقق من الهدف من خلال الاستقصاء الميكانيكي للتمايز العصبي، وتتيح تطوير المقايسات اللازمة لفحص المركبات في محافظ أبحاث العلوم العصبية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمسارات التطور العصبي والتحقق من الأهداف من خلال التمايز الموجه والقراءات القائمة على العلامات الحيوية.
- المسح: تتيح توحيد المقايسات وإعادة إنتاجها في المزارع أحادية الطبقة، حيث تعد كثافة الزرع معلمة حرجة لضمان توليد متسق للخلايا العصبية السلفية.
- التحليلات: توفر مخرجات كمية عبر التألق المناعي (مثل SOX1-GFP و βIII-tubulin) وقياس التدفق الخلوي لقياس كفاءة التمايز والاستجابة للمركبات.
- البحث الانتقالي: تربط عملية توليد الخلايا العصبية السلفية المبكرة بالنضج اللاحق إلى عصبونات وخلايا دبقية وظيفية، مما يدعم الاستمرارية في المرحلة قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يدعم البروتوكول المحدد والقابل للتوسع إعادة الاستخدام عبر خطوط متعددة من خلايا ESC، وأوعية زراعة مختلفة، وحملات مسح متنوعة، مما يقلل من جهود إعادة التطوير.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الأهداف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في مسارات التمايز العصبي.
- القيمة التشغيلية: تؤدي الظروف الموحدة الخالية من المصل إلى تحسين قابلية التكرار والتوسع عبر المختبرات وخطوط الخلايا المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين التقييم المبكر لتأثيرات المركبات على الالتزام بالسلالة العصبية وكفاءة التمايز.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات للأهداف العصبية بناءً على المخاطر المعدلة من خلال تقليل المخاطر الميكانيكية والتحقق من صحة المسارات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية، وتقنيات التمايز، والمجهر الفلوري المناعي.
- يعتمد على توفر حضانات CO2، وأجهزة طرد مركزي، ومجاهر، وكواشف مثل الجيلاتين، وN2B27، وكواشف التفكيك، والأجسام المضادة.
- يستلزم توحيد كثافة الزرع وإجراءات طلاء الجيلاتين بين المستخدمين والمواقع لضمان قابلية التكرار.
- قد يتطلب التكيف مع سلالات ESC المختلفة أو تركيبات المراسل تحسيناً لكثافة الاستزراع وتوقيت التمايز.
- تشمل القيود العملية الحساسية تجاه كثافة الزرع والحاجة إلى تفكيك دقيق للطبقة أحادية الخلية لتجنب التكتل أو عدم اكتمال معلق الخلايا المفردة.
