والمائية الميكروبية Metaproteomics سير العمل: من الخلايا إلى زيتية الببتيدات مناسبة لتحليل يستند الطيف، جنبا إلى جنب الشامل

الهدف من هذا الإجراء هو استخلاص البروتين والحمض النووي DNA من الكتلة الحيوية الميكروبية المستمدة من مياه البحر، يلي ذلك توليد ببتيدات تريبتيكية لتحليل بروتومي يعتمد على مطيافية الكتلة الترادفية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحلل الخلايا التي تم تجميعها مسبقاً على مرشح خرطوشي. وتتمثل الخطوة الثانية في تركيز ناتج تحلل الخلايا باستخدام وحدات ترشيح بالطرد المركزي الفائق.

بعد ذلك، يتم فصل المستخلص إلى جزأين، أحدهما لترسيب البروتين والآخر لترسيب DNA. وتتمثل الخطوة النهائية في إجراء هضم تريبسيني للبروتينات داخل الهلام (ingel trypsin digestion) واستخلاص الببتيدات المناسبة لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة ومطياف الكتلة الترادفي. وفي النهاية، يمكن استخدام التحليل المعلوماتي الحيوي اللاحق لتحديد البروتينات المعبر عنها في العينة، بينما يمكن استخدام DNA المعزول لتحليل الميتاجينوميات و/أو تحليل جين 16 S-R-R-N-A.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في إمكانية عزل كل من البروتين وDNA من العينة نفسها في وقت واحد. للبدء، قم بتفريغ محلول تثبيت RNA من وحدة ترشيح الخرطوشة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل، باستخدام حقنة سعة 60 مل متصلة بنهاية القفل اللولبي لجهاز الطرد المركزي المرشح، ثم ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل لمدة 10 دقائق عند 17,000 ×g لترسيب أي حطام خلوي بعد عملية الطرد المركزي. انقل السائل الطافي إلى وحدة ترشيح فائقة الطرد المركزي 10 K لالتقاط أي بروتينات ناتجة عن الخلايا التي تحللت من العينة.

لا تتخلص من الراسب. قم بإجراء عملية الطرد المركزي لوحدة فلترة الطرد المركزي الفائق عند 3,270 ×g لمدة 30 دقيقة أو حتى ينخفض الحجم إلى حوالي 600 µL. وفي هذه الأثناء، قم بصهر طرف ماصة P 10 وسد الجانب غير المزود بقفل Luer في وحدة فلترة الخرطوشة باستخدام الطرف المفتوح للماصة.

سيضمن ذلك عدم تسرب محلول الاستخلاص والكتلة الحيوية خلال الخطوات المستقبلية. يتم تعليق الراسب في 1 mL من محلول استخلاص SDS ونقله باستخدام الماصة إلى وحدة مرشح الخرطوشة الأصلية. وأسهل طريقة للنقل بالماصة إلى وحدة مرشح الخرطوشة هي تركيب رأس ماصة P 200 فوق رأس ماصة P 1000 واستخدام هذا الرأس المزدوج في عملية النقل. أضف 1 mL إضافيًا من محلول استخلاص SDS إلى وحدة مرشح الخرطوشة بحيث يصبح الحجم الإجمالي حوالي 2 mL.

شريط البارافلم (Para film). يتم إغلاق طرف القفل اللولبي (lure lock) لوحدة مرشح الخرطوشة ووضع وحدة مرشح الخرطوشة في أنبوب سعة 50 milliliter. بعد ذلك، توضع ثلاث من المناديل المخبرية المجعدة في قاع أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

أغلق الغطاء وضع الأنبوب في فرن التهجين للتحضين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع التدوير. بعد مرور 10 دقائق، ضع المرشح على طافٍ رغوي وثبته في مكانه باستخدام حقنة سعة 5 مل في طرف القفل اللولبي، ثم قم بالتحضين في حمام مائي عند درجة حرارة 95 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، اترك وحدة المرشح الخرطوشي لتبرد وتدور في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وبمجرد أن تبرد، قم بطرد محلول استخلاص SDS ونواتج تحلل الخلايا من المرشح باستخدام حقنة سعة 60 مل في نفس وحدة المرشح للطرد المركزي الفائق.

كما في السابق، أضف 1 mL من محلول استخلاص SDS الطازج إلى وحدة فلتر الخرطوشة واخلطها يدوياً لمدة 30 ثانية. ثم ادفع محتويات الفلتر إلى وحدة الفلتر الطارد المركزي الفائق باستخدام حقنة سعة 60 mL للشطف وضمان إزالة وجمع كافة البروتينات. قم بإجراء عملية الطرد المركزي لوحدة الفلتر الطارد المركزي الفائق لمدة 45 دقيقة عند 3,270 ×g، أو حتى يصبح الحجم في وحدة الفلتر أقل من 600 µL.

تخلص من السائل المار (flow through) ثم املأ وحدة الترشيح بالطرد المركزي الفائق بمحلول استخلاص SDS جديد. قم بطرد وحدة الترشيح مركزياً لمدة 45 دقيقة أخرى بسرعة 3,270 ×g، وكرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين. تأكد من أن الحجم النهائي في وحدة الترشيح بالطرد المركزي الفائق لا يتجاوز 600 µL في نهاية عملية الطرد الأخيرة.

في هذه المرحلة، قم بقياس حجم المركز ثم قسّمه إلى جزئين؛ حيث سيُستخدم أحد الجزأين لترسيب DNA والآخر لترسيب البروتين. ولترسيب البروتين، أضف أربعة أحجام من الميثانول والأسيتون بنسبة 50 إلى 50 لكل حجم واحد من المركز، ثم استخدم جهاز الـ vortex لمدة 10 ثوانٍ، واتركه في الحاضنة طوال الليل عند درجة حرارة -20 °C.

في اليوم التالي، قم بطرد الخليط مركزياً بسرعة 17,000 ×g لمدة 30 دقيقة. بعد سحب السائل الطافي، اترك الراسب ليجف في جهاز التجفيف بالتفريغ (speed vac) لمدة ساعة واحدة. تجنب التجفيف المفرط للراسب لأن ذلك قد يجعل من الصعب إعادة تعليقه.

قم بتعليق الراسب في 25 µL من محلول استخلاص SDS. اتركه لمدة ساعة واحدة ثم أعد تعليقه عن طريق السحب والإفراغ باستخدام الماصة. قم بإجراء فصل بروتيني بواسطة SDS page على البروتينات كما هو مفصل في البروتوكول النصي، مع العمل داخل كابينة السلامة البيولوجية لتقليل التلوث، ثم قص الجزء الزائد من الهلام الموجود أسفل علامة 10 kilodalton في السلم الجزيئي لكل ممر.

سيتم تحليل كل مسار باستخدام مقياس طيف الكتلة الترادفي. وبشكل منفصل، يتم تقطيع كل مسار إلى مربعات بحجم 1 mm في 1 mm لزيادة مساحة السطح، ثم توضع جميع المربعات الناتجة من المسار في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط. يُكرر ذلك لجميع المسارات، ويمكن استخدام 1% Acetic acid لمنع جفاف الهلام مما يجعل تقطيعه صعباً.

استمر في إجراء هضم التريبسين داخل الهلام واستخلاص الببتيد كما هو موضح في البروتوكول النصي، أو قم بترسيب الحمض النووي DNA في محلول استخلاص SDS لتركيز الجزء الذي سيُستخدم في ترسيب الحمض النووي DNA حتى علامة 500 microliter. تهدف هذه الخطوة ببساطة إلى زيادة حجم المحلول، مما يسهل التعامل معه. بعد ذلك، أضف 0.583 من أحجام كاشف ترسيب البروتين، مثل كاشف MPC لترسيب البروتين، ثم استخدم جهاز المرج (vortex).

لمدة 10 ثوانٍ، يتكون راسب أبيض؛ ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي عند 17,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي، يتم نقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 milliliter وإضافة 0.95 حجم من الإيزوبروبانول، مع قلب الأنبوب من 30 إلى 40 مرة قبل الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C وبأقصى سرعة، ثم يُسكب السائل الطافي بعناية ويُتخلص منه. بعد ذلك، يتم شطف الراسب مرتين باستخدام 750 µL من الإيثانول بتركيز 70%.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول باستخدام الماصة، ثم اترك الراسب ليجف في الهواء. لا تبالغ في تجفيف الحمض النووي DNA، لأن ذلك قد يجعل من الصعب إعادة تعليقه بمجرد أن يجف. أعد تعليق الراسب في 25 µL من محلول التخزين المنخفض درجة الحرارة low T buffer P eight.

قم بقياس كمية الـ DNA باستخدام طقم تحليل الـ DNA مزدوج السلاسل ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم أيضاً بإجراء الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز على ثلاث ميكرولترات من الـ DNA للتحقق من جودته، وقد خضعت الببتيدات لتحليل مطيافية الكتلة الترادفية من الببتيدات. تم توليد أكثر من 23,000 طيف لكل عينة، والتي تم من خلالها تحديد الببتيدات والبروتينات.

تم تحليل التركيب التصنيفي والوظيفي للميتابروتيومات باستخدام مزيج من blast P ومحلل الميتاجينوم (metagenome analyzer). كانت البروتينات المنسوبة إلى alpha proteobacteria هي الأكثر تمثيلاً في مجموعة البيانات، حيث نُسبت الغالبية العظمى منها إلى سلالة SAR R 11.

تم تمثيل وتحديد مجموعة Roter من Alpha Proteobacteria بشكل كبير أيضاً، وغالباً ما كانت موجودة في المياه السطحية. كانت البروتينات المرتبطة بأمراض البكتيريا موزعة بالتساوي بين السطح ومستوى الحد الأقصى للكلوروفيل، بينما تم تحديد بروتينات البكتيريا السوطية بدرجة أكبر عند مستوى الحد الأقصى للكلوروفيل.

توزعت بروتينات البكتيريا من طائفة غاما (Gamma proteobacteria) بشكل متساوٍ في جميع أنحاء العمود المائي، بينما وُجدت بروتينات البكتيريا من طائفة بيتا (beta protio bacterial) بشكل أساسي في السطح. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثلاثة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح.