الكشف الموضعي من البكتيريا داخل أنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من استخدام المسمى الديجوكسين DNA التحقيق استهداف 16S الريباسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو توطين البكتيريا داخل الأنسجة المضمنة في البارافين باستخدام DIG المسمى 16 ثانية ريبوسومي ، RNA ، مستهدف مجسات الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد المسبار أولا مع تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ووضع العلامات على DIG. الخطوة الثانية هي إعداد أقسام الأنسجة للحصول على مواقع مستهدفة يسهل الوصول إليها وربط أقل للخلفية.

بعد ذلك ، يتم تهجين أقسام الأنسجة المحضرة باستخدام مسبار الحفر المسمى. أخيرا ، تم الكشف عن المسبار المهجن باستخدام الفوسفاتيز القلوي ، المسمى الأجسام المضادة للحفر المضادة ل D. في النهاية ، يمكن أن تظهر طريقة التهجين هذه في C two وجود بكتيريا مع أنسجة البارافين.

ميزة المجال لهذا الاكتشاف على الطريقة الحالية مثل ING هي أن هذه الطريقة يمكنها اكتشاف البكتيريا SHS في سياق بعض الهياكل النسيجية. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتسبب في المرض ، ولكنها ستؤدي إلى التهابات مختلفة مثل التهاب دواعم السن وكوكب R. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تشغيل خطوات تحضير الأنسجة والهضم الهجين لأن أقسام الأنسجة تتلف بسهولة.

لجعل مسبار بكتيريا U ، استخدم زوجا مكونا من 70 قاعدة ، وجزء من الحمض النووي كقالب واثنين من 15 زوجا أساسيا لتضخيم المسبار بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). اجمع الأمبليكون في المخزن المؤقت بتركيز معروف. ثم قم بتسمية المسبار بمجموعة أدوات وضع العلامات على الحمض النووي والكشف عنه.

قم أولا بخلط ثلاثة ميكروغرامات من المسبار في 15 ميكرولتر من الماء. قم بتغيير طبيعة المسبار في الكتلة الحرارية لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. ثم ضع المسبار المشوه على الجليد.

بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من 10 نيوكليوتيدات XH ، ولترين من DN NTPs ، وميكرولتر واحد من إنزيم القناة. بمجرد الخلط ، اترك المسبار يحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة لاحقا. أوقف التفاعل عن طريق تسخين الخليط إلى 65 درجة مئوية.

ثم قم بقياس تركيز الحمض النووي للمسبار المسمى عند 260 نانومتر واضبط التركيز على 100 نانوجرام لكل ميكرولتر. باستخدام المجموعة ، تحقق من حساسية المجسات أولا على غشاء النايلون ، وتحميل ميكرولتر واحد من التحكم الإيجابي المخفف متسلسلا. التحقيق والحفر المسبار المسمى.

دع الغشاء يجف لمدة خمس دقائق. بمجرد أن يجف ، اغمس الغشاء لفترة وجيزة في اثنين من XSSC ثم انقله إلى حاضنة 80 درجة مئوية لمدة ساعة. لتثبيت الحمض النووي بعد الحضانة ، انقع الغشاء لفترة وجيزة في عازلة حمض الماليك ، ثم انقله إلى مخزن مؤقت مانع مركز مع الأجسام المضادة المترافقة AP عند تخفيف من واحد إلى 5،000 بعد نصف ساعة.

اغسل الغشاء في MABT. ثم امزج 40 ميكرولترا من N-B-T-B-C-I-P في ملليلترين من المخزن المؤقت للكشف. وبعد الاستحمام ، أضف هذا الخليط إلى الغشاء لمدة دقيقة واحدة.

بعد إزالة البارافين وإعادة ترطيب أقسام الأنسجة كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإعدادها للتهجين في C Two ، قم أولا بغمر الشرائح في 0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي لمدة 20 دقيقة. بعد الحمام الحمضي ، اغسل الشرائح بالماء المعالج DEPC لمدة 30 ثانية. ثم باستخدام قلم الشمع ، حدد الخطوط العريضة للعينات في كل شريحة.

بعد ذلك ، أضف 50 إلى 400 ميكرولتر من محلول البروتيناز K إلى العينات ، اعتمادا على حجمها. اسمح للإنزيم بالعمل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ثم اغسل الشرائح في DEPC معالجة XPBS لمدة دقيقة واحدة. الآن انقل الشرائح إلى 4٪ ألدهيد بارافورم في برنامج تلفزيوني معالج DEPC لمدة 10 دقائق.

اغسل المثبت باستخدام PBS كما كان من قبل. ثم اغسلي الشرائح في 0.1 مولار ثلاثي إيثانول أمين هيدروكلوريد عند درجة الحموضة ثمانية مع 0.5٪ من الخليك والهيدريد بعد 20 دقيقة ، اغسل الشرائح بالماء النظيف كما كان من قبل. ابدأ الآن في C اثنين عن طريق غمر الشرائح أولا في اثنين من XSSC لمدة 20 دقيقة.

وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف المسبار المسمى إلى نانوغرام واحد لكل ميكرولتر في مخزن مؤقت للتهجين للحصول على تحكم سلبي. استخدم 10 أضعاف تركيز مسبار المسبار غير المصنف. ثم قم بتغيير طبيعة المجسات عن طريق تسخينها عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعا بتبريدها بسرعة على الجليد.

بعد ذلك ، قم بتطبيق نفس حجم تخفيف المسبار على كل شريحة مثل البروتيناز K الذي تم تطبيقه مسبقا. ثم قم بتغطية أقسام الانزلاق والختم بعناية باستخدام طلاء الأظافر. الآن ، قم بتسخين الشرائح على كتلة جهاز PCR عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وانقلها إلى حاضنة رطبة 45 درجة مئوية طوال الليل في اليوم التالي.

قم بتبريد الشرائح عند أربع درجات مئوية لمدة نصف ساعة ، ثم قم بإزالة زلات الغطاء بعناية. الأنسجة هشة. أخيرا ، قم بتمرير الشرائح عبر سلسلة من المخزن المؤقت SSC في درجة حرارة الغرفة.

أولا ، اغسل الشرائح المهجنة NC لمدة خمس دقائق في MABT. ثم ضع 50 إلى 400 ميكرولتر من محلول الحجب في 1٪ 20 لمدة 20 دقيقة. بعد حضانة الكتلة ، قم بتطبيق 50 إلى 400 ميكرولتر من واحد إلى 1000 من الأجسام المضادة للفوسفاتيز القلوية المضادة ل D ومحلول الحظر.

اتركه يرتبط لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية بعد تطبيق الابتدائية. اغسل الشرائح في MABT لمدة 10 دقائق. ثم لمدة خمس دقائق ، ضع الشرائح في المخزن المؤقت للكشف مع 1٪ tween 20.

الآن ضع 50 إلى 400 ميكرولتر من واحد مليمولار أولي في محلول عازلة للكشف على كل شريحة ، واحتضنها لمدة خمس دقائق لتعطيل الفوسفاتيز القلوي الداخلي. بعد ذلك ، أضف 50 إلى 400 ميكرولتر من N-B-T-B-C-I-P المخفف في الكشف. قم بالتخزين المؤقت من واحد إلى 100 لكل شريحة ، واترك الشرائح تحتضن لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في غرفة رطبة بناء على الخبرة.

اشطف الشرائح بماء DI ، ثم ضع الميثيل الأخضر بوزن 0.05٪ من حيث الحجم واترك البقعة المضادة تعمل على الأنسجة لمدة 10 دقائق. عند 37 درجة مئوية. اغسل الشرائح بماء DI مرة أخرى ، ثم قم بتجفيفها باستخدام 100٪ من الإيثانول ، متبوعا بغمس في الزيلين.

أخيرا ، ضع 80 ميكرولترا من وسائط التثبيت وقلة الغطاء. تم تسمية الشرائح بعد المجسات الحفر. تمت مقارنة حساسيتهم بتخفيف مسبار التحكم الإيجابي.

كان المسبار الخاص ب 3 43 زوج أساسي p gingivalis أكثر حساسية 25 مرة من مسبار البكتيريا المكون من 70 زوجا أساسيا. ثم تم تطبيق المجسين على أنسجة اللثة من المرضى الذين يعانون من التهاب دواعم السن المزمن بتكبير عالي. كان من الممكن تمييز الأشكال المختلفة للبكتيريا باستخدام مسبار البكتيريا.

في حين أن المسبار الخاص p gingivalis اكتشف فقط البكتيريا على شكل قضيب ، تم تطبيق تقاطع ضيق يعطل DSS الكيميائي على الغشاء المخاطي للثة للفئران. تم استخدام عينات الأنسجة من هذه الفئران لمقارنة المجسات في سياق مختلف. هنا ، كان المسبار البكتيري U قادرا على اكتشاف البكتيريا التي لم يستطع الآخر.

تم اختبار مسبار بكتيريا U بعد ذلك لقدرته على اكتشاف البكتيريا الأخرى في أقسام أنسجة الرئة التي تحتوي على أورام. تم الكشف عن البكتيريا خارج الورم وكذلك داخل الورم. عند فحص الأنسجة من المرضى الذين يعانون من الحزاز المسطح الفموي وهو مرض غير معروف المسببات ، اكتشف مسبار البكتيريا إشارات بكتيرية داخل خلايا الظهارة والصفيحة المخصوصة حيث لوحظ تسلل التهابي.

منذ تطويرها ، ساعدت هذه التقنية الباحث في مجال الأمراض المعدية على استكشاف غزو البكتيريا للأنسجة في كل من البشر باتباع هذا الإجراء. يمكن أن تكون طرق أخرى مثل النمو في الكشف عن المواد الكيميائية المناعية إلى علامة الخلية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل نوع الخلايا التي تؤوي البكتيريا داخل الأنسجة.