تصميم وبناء الاصطناعي خارج الخلية مصفوفة (aECM) والبروتينات من الإشريكية القولونية للبشرة هندسة الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح الخطوات المتبعة في بناء وإنتاج بروتينات ECM الاصطناعية أو ECM التي تحتوي على تكرارات مثل الإيلاستين. يتم تحقيق ذلك عن طريق بناء الجينات المؤتلفة أولا التي تشفر بروتينات A ECM. بعد ذلك ، يتم إدخال الجينات المؤتلفة في المضيفات البكتيرية.

في هذه المرحلة ، يتم التعبير عن البروتينات المؤتلفة في المضيفين البكتيريين ثم يتم حصادها بعد استخراج البروتين من خلال تحلل الخلايا. تتمثل الخطوة الأخيرة في تنقية البروتينات باستخدام دورة الانتقال العكسي أو ITC ، والتي تستغل سلوك انتقال الطور الفريد للإيلاستين. مثل عديد الببتيدات.

تتم دورات الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية و 37 درجة مئوية. في النهاية ، يتم استخدام تقنيات الرحلان الكهربائي للهلام واللطخة الغربية لتحديد البروتينات المؤتلفة وتحديد نقائها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل أعمدة التقارب ، هي أنه يمكننا استخراج كمية كبيرة من البروتينات بثمن بخس نسبيا.

ابدأ هذا الإجراء بتصميم جميع الأربطة كما هو موضح في بروتوكول النص. بمجرد الحصول على القلة ، قم بعمل قلة الحمض النووي للحصول على التسلسل الجيني المطلوب. قم أولا بإذابة قليل النوكليوتيدات الحمض النووي في مخزن الحمض النووي oligo إلى تركيز نهائي يبلغ ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر.

أضف أربعة ميكرولترات من كل أربطة إلى 32 ميكرولتر من الحمض النووي ومخزن مؤقت للركوع لتحقيق خليط إجمالي 40 ميكرولتر. ثم اغلي دورق من الماء باستخدام طبق ساخن واغمر الخليط لمدة خمس دقائق. عند 95 درجة مئوية ، قم بإزالة الدورق وقم بتبريد الإعداد بالكامل تدريجيا في صندوق من الستايروفوم طوال الليل ، وقد ركع القلة الآن وجاهز للهضم.

أضف إنزيمات التقييد المقابلة لهضم القلة قليلة ونواقل المضيف بشكل منفصل كما هو موضح في نص ملخص البروتوكول لمدة ثلاث إلى أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد تشغيل منتجات الهضم على هلام الاغاروز وتنقية الحمض النووي ، اجمع بين الجين المعني بالتتابع عن طريق ربط إدخال الحمض النووي المهضوم في ناقل البلازميد باستخدام T four ligase. باستخدام الوصفة الموجودة في بروتوكول النص ، احتضان خليط الربط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، قم بتحويل الخلايا باستخدام صدمة حرارية بواسطة Ali. نقلا عن 50 ميكرولترا من الخلايا المختصة في أنابيب طرد مركزي دقيقة نظيفة ومبردة مسبقا. ماصة خمسة ميكرولترات من خليط الربط في الخلايا ، ماصة برفق لأعلى ولأسفل لتختلط.

اتركي الخليط على الثلج لمدة 20 دقيقة. ثم اغمر أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على خليط الخلية في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين والعودة إلى الجليد لمدة دقيقتين. أضف 500 ميكرولتر من وسائط SOC إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة ، انشر 50 إلى 500 ميكرولتر من خليط ربط الخلايا على صفيحة مثقاب YT مرتين تحتوي على أمبيسلين تم تسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة. احتضان الصفائح رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، اختر مستعمرات الحمض النووي من لوحة المثقاب باستخدام أطراف ماصة نظيفة.

تنمو المستعمرات في خمسة ملليلتر من مرتين. تحتوي وسائط YT على أمبيسلين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الاهتزاز في اليوم التالي. استخدم مجموعة عزل البلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لاستخراج بلازميدات الحمض النووي لكل مستعمرة.

الملتقط ، الحمض النووي الذي يحتوي على 50 ميكرولتر من الماء بعد تحويل البلازميد المؤتلف إلى مضيف التعبير البكتيري كما هو موضح في بروتوكول النص. اختر مستعمرة من لوحة المثقاب المحولة بتلقيح طرف الماصة. 10 ملليلتر من مرق معقم أو رائع أو وسائط السل التي تحتوي على كل من المضادات الحيوية الأمبيسلين والكلورامفينيكول في أنبوب اختبار.

احتضن ثقافة البداية هذه عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة. ثم انقل 10 مل من ثقافة البداية إلى لتر واحد من وسائط السل الطازجة والمعقمة. تستكمل بنفس المضادات الحيوية في قارورة إرلين ماير سعة ثلاثة لترات.

احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 225 RRP M لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. راقب الكثافة البصرية للثقافة عند 600 نانومتر أو OD 600 للتأكد من أنها وصلت إلى 0.6 إلى 0.8 عن طريق سحب مليلتر واحد من المزرعة في طبيب بيطري Q فارغ للقراءة. بعد ذلك ، قم بتحفيز المزرعة باستخدام IPTG إلى تركيز نهائي يبلغ مللي مولار واحد واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات أخرى.

حصاد الخلايا عن طريق نقل المزرعة إلى جهاز طرد مركزي سعة لتر واحد وزجاجات وأجهزة طرد مركزي عند 12،000 Gs لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بوزن كريات الخلية وأعيدها في 10 عازلة بمعدل 0.5 جرام لكل مليلتر. قم بتجميد زراعة الخلايا المعلقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي قم بإذابة مزرعة الخلايا المجمدة في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة أو على الجليد. إلى L تضيف الخلايا ديوكسي ريبونوكلياز واحد ريبونوكلياز أ وفينيل ميثيل سوين فلوريد. أثناء إذابة المحلول ، قم بتجانس المحلول مع التحريك البطيء.

بعد إذابة جميع الخلايا المعلقة ، اضبط المحلول على درجة الحموضة 9.0 لزيادة قابلية ذوبان البروتين في الماء بحذر شديد. إضافة ستة نيوتن هيدروكسيد الصوديوم بالتنقيط مع التقليب على الثلج لتحقيق تناسق متجانس. ثم قمل الخلايا عن طريق التعطيل بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة على الجليد ، باستخدام طرف مسطح قطره ملليمترين ونبض خمس ثوان.

الطرد المركزي لمحلول الخلية عند 12،000 Gs لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل السوفنات إلى زجاجة نظيفة وفارغة واحفظها على حرارة أربع درجات مئوية لتنقيتها لاحقا. وفي الوقت نفسه ، أعد تعليق حبيبات الخلية مرة أخرى باستخدام 10 عازلة ووفر 20 ميكرولترا من محللات الخلية.

لتوصيف صفحة SDS ، أعد تجميد حبيبات الخلية المعلقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لإكمال تحلل الخلية. كرر عملية التجميد والذوبان والصوتنة حتى ثلاث مرات. قم بتجميع محللة الخلية من وقت سابق وانتقل إلى تنقية بروتينات A ECM باستخدام ITC حيث يتم إجراء دورات الطرد المركزي في درجات حرارة مختلفة في ظروف الملح العالية.

قسم محللة الخلية إلى أجهزة طرد مركزي وزجاجات وأجهزة طرد مركزي سعة 50 مليلتر عند 40،000 جي سات لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة للحصول على فصل نظيف عن الحبيبات. اجمع المادة الطافية في زجاجات طرد مركزي نظيفة وأضف كلوريد الصوديوم إلى التركيز النهائي لضر واحد.

سخني المحلول إلى 37 درجة مئوية لمدة ساعتين مع الرج عند 225 دورة في الدقيقة. جهاز الطرد المركزي التالي. المادة الطافية عند 40،000 جي لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

بعد الصب ، يسحق المادة الطافية الحبيبات باستخدام ملعقة معدنية ويعيد تعليق بتات الحبيبات في الجليد. الماء المقطر البارد بالأوتوكلاف مع التحريك القوي طوال الليل عند أربع درجات مئوية باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي واللوحة حتى تذوب الحبيبات تماما. كرر هذه الدورات حتى تصبح الحبيبات عند 37 درجة مئوية بيضاء ، وعند هذه النقطة يمكن إذابتها في الماء طوال الليل وأجهزة الطرد المركزي.

للحصول على محلول البروتين ، قم بتحلية محلول البروتين عن طريق غسيل الكلى ضد الماء المقطر عند أربع درجات مئوية ، وتغيير الماء كل أربع ساعات أو ثماني ساعات طوال الليل لمدة يومين إلى ثلاثة أيام بعد توفير 20 ميكرولترا من البروتين المنقى لصفحة SDS ، قم بتجميد باقي البروتين المنقى كما هو موضح هنا. يكون نطاق البروتين المكثف في الوزن الجزيئي المتوقع في العينة المستحثة. يظهر أيضا جل صفحة SDS الذي يحتوي على عينة بروتين منقى بوزن جزيئي يبلغ 22 كيلودالتون يتوافق مع اللامينين خمسة A ECM.

يبلغ النقاء المقدر لبروتينات A ECM حوالي 90 إلى 95٪ تم اشتقاق هذه القيمة من خلال مقارنة نسب شدة النطاق للبروتين المستهدف ونطاقات البروتين الأخرى الموجودة على هلام SDS. أخيرا ، لتحديد ما إذا كان البروتين المنقى هو بالفعل بروتينات A ECM ، تم إجراء النشاف الغربي هنا. يظهر نقاء البروتين لبروتينات A ECM الثلاثة باستخدام هلام صفحة SDS ومقارنته بصورة لغشاء النيتروسليلوز للنشاف الغربي.

يكشف التحليل عن وجود البروتينات المستهدفة الكولاجين أربعة A ECM ، والصفائح الخمسة A ECM الموسومة باستخدام الأجسام المضادة لعلامة الهيستيدين المضادة المقترنة ببيروكسيداز فجل الحصان. تراوحت الغلة النهائية لبروتينات A ECM بين 60 ملليغرام لكل لتر إلى 120 ملليغرام لكل لتر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقليص وتنقية البروتينات التي تحتوي على مجالات ضوء الإيلاستين لتطبيقك المحدد.