إسكات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إسكات تعبير B RCA two عن طريق ترانسفكشن (transfection) لـ SIR A. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير معقدات كاشف الترانسفكشن لـ SIR a. بعد ذلك، يتم إجراء الجولة الأولى من الترانسفكشن عن طريق إضافة المعقدات قطرة تلو الأخرى إلى طبقة أحادية من الخلايا التي تصل درجة تلاقيها (confluency) إلى 80%. ثم يتم إجراء جولة ثانية من ترانسفكشن SIR a باستخدام نسبة أعلى من SIR A إلى كاشف الترانسفكشن.

أخيراً، تُغسل الطبقات الخلوية الأحادية بمحلول PBS بارد جداً، ثم يتم تحلل الخلايا عند درجة حرارة 4 °C باستخدام محلول منظم للتحلل يعتمد على المنظفات. وفي النهاية، يُستخدم تحليل Western blotting لإظهار إسكات B RCA A two على مستوى البروتين. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تسمح بإسكات فعال للجينات بالإضافة إلى الكشف الأمثل عن البروتينات ذات الوزن الجزيئي العالي مثل B RCA two الكابت للأورام. للبدء، بعد تنمية طبقات أحادية من الخلايا الظهارية البشرية عند 37 °C و5% carbon dioxide في غرفة رطبة، أزل وسط النمو واستخدم محلول PBS بدرجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا.

لفصل الخلايا عن الطبق، أضف 2 mL من محلول 0.25%trypsin و 0.53 mM EDTA، ثم قم بالتحضين لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق حسب نوع الخلايا. قم بمعادلة trypsin عن طريق إضافة 2 mL من وسط نمو كامل يحتوي على 10%FBS قبل نقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 mL. ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي ذو دوار ذو دلاء متأرجحة، وقم بالطرد المركزي عند 320 to 330 Gs ودرجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث دقائق.

استخدم خمسة ملليلترات من وسط خالٍ من المضادات الحيوية لإعادة تعليق الرواسب قبل استخدام غرفة بوركر أو نظام عد آلي لعد الخلايا. بعد ذلك، ضع ما يقرب من 0.5 إلى 1 × 10⁶ خلية في مليليترين من وسط خالٍ من المضادات الحيوية في كل بئر من أطباق ذات ستة آبار، واحضنها لمدة 24 ساعة حتى تصل نسبة التلاقي إلى 80%. بعد فترة الحضن، ابدأ الجولة الأولى من عملية عفن الخلية (transfection) عن طريق تخفيف 6 ميكرولتر من كاشف عفن الخلية النوعي لـ irna القائم على الدهون في 130 ميكرولتر من وسط منخفض المصل.

قم بتخفيف 3 µL من S irna بتركيز 10 µM في 130 µL من وسط مصل مخفض. اخلط الـ irna المخفف مع كاشف ترانسفكشن مخفف، ثم حضنه لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأثناء فترة التحضين، قم بإزالة الوسط من الخلايا وأضف 2 mL من وسط جديد خالي من المضادات الحيوية.

يتم التسخين المسبق عند 37 °C. بعد ذلك، تُضاف 250 µL من معقدات كاشف ترانزفكشن siRNA إلى كل بئر من آبار الخلايا في طبق سداسي الآبار. ثم تُحضن الخلايا في حضانة رطبة عند 37 °C مع 5% CO2.

بعد مرور 24 ساعة، يتم تخفيف 5 µL من irna بتركيز 10 µM في 130 µL من وسط مصل مخفض، ثم البدء في جولة ثانية من عفن التحول (transfection) كما هو موضح. إن التركيز العالي لـ sarna في الجولة الثانية ضروري لتحقيق كفاءة عالية في إسكات B rca الثنائي.

قم بتحضين الخلايا عند 37 °C لمدة تتراوح من يوم إلى يومين قبل التحليل لتحضير محلول التحلل الخلوي لتحليل اللطخة المناعية. قم بتحضير محلول تحلل حديث وفقاً للوصفة الموضحة هنا. قم بإزالة الوسط من الخلايا وأضف 2 mL لكل بئر من محلول PBS البارد جداً لغسل الخلايا.

بعد ذلك، قم بإزالة PBS تماماً من الطبق وأضف 200 µL من محلول التحلل (lysis buffer) المبرد إلى كل بئر. قم بتدوير الطبق بلطف لتوزيع محلول التحلل بشكل متجانس، ثم حضنه على جهاز تدوير عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة. ثم استخدم كاشطة الخلايا.

اجمع ناتج تحلل الخلايا في أنبوبة طرد مركزي دقيقة على الثلج، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 17,900 Gs ودرجة حرارة 4 °C لمدة 25 دقيقة، واجمع السائل الطافي لإجراء تحليل اللطخة المناعية. قم بتحضير محاليل الفصل الكهربائي عن طريق تخفيف 50 ملليلتر من محلول tris acetate SDS running buffer بتركيز 20x باستخدام 950 ملليلتر من الماء المقطر. قم بتحضير العينة وفقاً لما يلي.

أضف 15 µg من مستخلص الخلايا الكلي. خمسة µL من منظم عينات بتركيز 4x يحتوي على كبريتات الليثيوم ESAL بأس هيدروجيني pH 8.4 و 2 µL من DTT بتركيز 0.5 M ومنظم التحلل (lysis buffer) ليصل الحجم الإجمالي إلى 20 µL. قم بمسخ العينات عند درجة حرارة 55 °C لمدة 10 دقائق.

من الضروري استخدام درجة الحرارة هذه لأن بروتين b RCA two حساس للحرارة. بعد ذلك، قم بتجهيز غرفة الرحلان الكهربائي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ثم قم بتحميل العينات مع 10 µL من معيار بروتيني عالي الوزن الجزيئي لإعادة الصبغ على هلام مسبق الصب، ثم قم بالتشغيل عند 120 فولت لمدة ساعتين تقريباً.

في هذه الأثناء، قم بتحضير محلول النقل باستخدام 50 milliliters من محلول نقل بتركيز 20x، و100 milliliters من methanol بتركيز 100%، و850 milliliters من الماء. قم بتنشيط غشاء PVDF عن طريق نقعه في methanol بتركيز 100% لمدة خمس دقائق. اشطف الغشاء بالماء المقطر وقم بموازنته في محلول النقل لمدة خمس دقائق على الأقل.

انقع إسفنج جهاز النقل في محلول النقل عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت الاستخدام. أوقف عملية الفصل قبل أن يخرج المؤشر الأزرق بوزن 55 kilodalton من الهلام المصبوب مسبقاً، وقم بتجميع "الساندوتش" بدءاً بثلاث إسفنجات منقوعة في محلول النقل. ثم ضع ورقة واحدة بسمك 3 mm مشبعة بمحلول النقل.

بعد ذلك، أضف الهلام، ثم غشاء PVDF المنشط، يليه ورقة ترشيح من الدرجة الثالثة (3M grade paper) مشربة بالمحلول المنظم، وأخيراً ثلاث إسفنجات مشربة. ضع هذه المجموعة في الجهاز وقم بنقل البروتينات بتيار شدته 350 مللي أمبير لمدة أربع ساعات عند درجة حرارة 4 °C، أو بتيار شدته 180 مللي أمبير عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد عملية النقل، استخدم TBS لغسل الغشاء، ثم قم بعملية الحجب لمدة ساعة واحدة باستخدام TBST وحليب مجفف خالي الدسم بنسبة 5%.

ثم استبدل المنظم بتسعة ملليلتر من منظم TBST milk الذي يحتوي على 30 µL من الأجسام المضادة للأرنب متعددة النسائل anti BCA two، وحضن الغشاء عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق في كل مرة، حضن المرشح لمدة ساعة واحدة مع 1 µL من الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرنب المقترن ببيروكسيداز الفجل، والمخفف في 10 ملليلتر من منظم TBST milk. بعد غسل الغشاء ثلاث مرات، قم بإجراء الكشف المناعي بالوميض الكيميائي KEMMA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتصوير النطاقات على أفلام ECL عالية الدقة لتأكيد نوعية إسكات B rca. A two. تم استخدام irna عشوائي (scrambled) جنباً إلى جنب مع B RCA two irna كما هو موضح هنا، وكما ذكرنا سابقاً، من المهم إجراء جولة ثانية من ترنسفكشن irna بنسبة ترنسفكشن irna عالية للحصول على كفاءة عالية في إسكات B RCA A two.

تظهر النتائج هنا الفرق في كفاءة الإسكات (knockdown) بين استخدام نسبة منخفضة ونسبة عالية من siRNA إلى عملية transfection اعتماداً على نوع الخلايا. قد يختلف الحد الأدنى من الوقت الأمثل للحصول على أعلى مستوى من إسكات الجينات بعد الجولة الثانية من transfection لـ siRNA؛ فعلى سبيل المثال، وكما هو موضح في هذا الشكل، تكفي 24 ساعة لخلايا الغدة الدرقية NTHY، بينما يلزم ما يصل إلى 48 ساعة لإسكات فعال لـ B RCA A two في خلايا البروستاتا PNT one A. يكون إسكات b RCA two مستقراً تماماً حتى اليوم السابع بعد الجولة الثانية من transfection. وكما ذكرنا سابقاً، فإن تمييع (denaturing) نواتج تحليل الخلايا عند درجة حرارة أعلى من 55 °C يؤدي إلى فقدان ما يصل إلى 50% من بروتين B RCA A two.

في هذه التجربة، تم فحص مدى حساسية خلايا PNT 1A التي تم فيها إسكات BRC A2 تجاه مثبط PARP وهو دواء rucaparib بعد معالجتها بالعقار لمدة 24 ساعة. ولوحظ انخفاض في تكاثر الخلايا يعتمد على الوقت في خلايا PNT 1A المستنفدة من BRC A2 مقارنة بمجموعات الضبط. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إسكات الجينات الطويلة المشفرة للبروتين باستخدام CRNA وكيفية الكشف بكفاءة عن نواتجها البروتينية من خلال إجراء حجب مناعي مُحسَّن بالإضافة إلى BRC A2.

يمكن تطبيق هذا الأمر على العديد من البروتينات الكبيرة الصعبة الأخرى، خاصة عندما يتم التعبير عنها بمستويات منخفضة جداً في الخلايا.