العزلة ونشر تعميم الخلايا السرطانية من ماوس السرطان نموذج

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وإكثار الخلايا الورمية الجائلة من الدم الكامل لنموذج فأر متجانس جينياً مصاب بورم خبيث مع نقائل سرطانية في الخلايا الكبدية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق طرد الدم الكامل الذي تم جمعه من الفئران مركزياً وعزل الطبقة البيضاء (buffy coat). بعد ذلك، يتم تحلل كريات الدم الحمراء في الطبقة البيضاء وجمع الخلايا الورمية الجائلة في شكل راسب.

تُغسل الخلايا بعد ذلك، وتُعلّق في وسط زراعي كامل، ثم يتم إكثارها في زراعة خلوية. وتظل الخلايا الورمية سريعة النمو قابلة للحياة عبر ممرات عديدة، ويمكن التحقق من ذلك باستخدام تقنيات التشخيص الجزيئي القياسية. وتكمن أهمية عزل الخلايا الورمية الدوارة باستخدام تقنيتنا في أنها توفر نموذجاً قابلاً للتكرار، والذي يمكن تحسينه للاستخدام المحتمل في سياق سريري.

ستقوم ميشيل نادو، وهي طالبة جامعية من مختبرنا، بتوضيح الإجراء معي. للبدء، يتم جمع الدم الكامل من نموذج ورم Ciea Kamau مع نقائل سرطان الخلايا الكبدية كما هو موضح في فيديو منفصل من JoVE. يتم طرد الدم الكامل الذي تم جمعه مركزياً عند 1,167 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد الانفصال إلى طبقات، قم بإزالة طبقة البلازما العلوية بعناية ونقلها إلى أنبوب 1.5 milliliter خالٍ من الروجن (rogen free) لاستخدامها في تجارب لاحقة، مثل الكشف عن الأحماض النووية الخالية من الخلايا. بعد ذلك، انقل طبقة الغشاء الأبيض (Buffy coat) إلى أنبوب 1.5 milliliter آخر خالٍ من الروجن (ROGEN free) تحضيراً لتحلل كريات الدم الحمراء. وتعد هذه الخطوة ضرورية لإزالة كريات الدم الحمراء المتبقية في طبقة الغشاء الأبيض قبل عزل الخلايا الورامية الدوارة.

ابدأ بتحضير محلول سعة لتر واحد من منظم تحلل خلايا الدم الحمراء بتركيز نهائي قدره 155 millimolar من كلوريد الأمونيوم، و 10 millimolar من TRIS. اضبط قيمة الـ pH للمحلول لتكون 7.5. خذ مقدار 2 إلى 4 mL كعينة من المخزون من مزيج منظم تحلل خلايا الدم الحمراء سعة لتر واحد.

بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى الأنبوب الذي يحتوي على الطبقة الكريمية (buffy coat) التي تم جمعها. اخلط محتويات الأنبوب عن طريق قلبه عدة مرات. ثم قم بحضانة الأنبوب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على سطح المختبر.

بعد ذلك، قم بطرد المحتويات المخلوطة مركزياً لمدة خمس دقائق. عند 1,167 ×g وبعد انتهاء عملية الطرد المركزي، ستتكون ركازة بيضاء اللون. تخلص من السائل الطافي المائل للحمرة ببطء وحذر في محلول مبيض بتركيز 10% دون تعريض الركازة لأي اضطراب.

بعد التخلص من الطافي، اغسل الراسب المائل للبياض في 1 mL من PBS. ثم قم بترسيب الخلايا مرة أخرى وأعد تعليقها في وسط استزراع كامل. انقل الخلايا المعاد تعليقها إلى طبق استزراع خلوي واحضن الخلايا عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على الهواء و 5% carbon dioxide.

قم بتغيير وسط استنبات الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام. وبعد مرور خمسة إلى سبعة أيام، ستكون الخلايا الورمية المتداولة قد التصقت بطبق استنبات الخلايا وبدأت في التكاثر. وذلك للتحقق من عزل الخلايا الورمية المتداولة لسرطان الخلايا الكبدية بشكل صحيح.

قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لقطعة محددة من جين بيتا جلوبين في الفأر، وفقاً لما وصفه وأثبته Stu. بعد ذلك، قم بصبغ الخلايا مناعياً باستخدام جسم مضاد متخصص في الواسم الخاص بالخلايا الكبدية. تُعد البروتينات الشبيهة بالبروتين الرابط للعنصر المستجيب لـ Cyclic A MP الثالث والمماثلة للثالث، باستخدام التقنيات القياسية الموضحة هنا، صوراً تمثيلية لخلايا ورمية دورانية من فأرين منفصلين.

في مستنبت من نموذج فأر متماثل جينياً موضعياً لسرطان الخلايا الكبدية. تلتصق الخلايا الورمية النقيلية بالطبق وتتكاثر بسرعة. ويمكن توسيع نطاقها لأكثر من 25 ممر، كما أنها تتحمل دورات التجميد والإذابة المتكررة.

لذا، بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وإكثار الخلايا الورمية الدائرية القابلة للحياة، بالإضافة إلى توصيفها جزيئياً ووظيفياً.