عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الكريات البيض المتسللة لواجهة جنين الأم الفئرانية. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الرحم والمشيمة و eua أولا. يتم تكسير الأنسجة عن طريق التفكك الميكانيكي في محلول إنزيمي ، يليه هضم إنزيمي لاحق.

ثم يتم ترشيح تعليق الخلية الناتج وغسله ، وعند هذه النقطة يتم فصل الخلايا المناعية ذات الأهمية عن بقايا الخلايا مثل الخلايا غير القابلة للحياة بواسطة تدرج مصل الأبقار الجنيني. في النهاية ، يمكن استخدام الكريات البيض المعزولة لتنميط الخلايا المناعي أو فرز الخلايا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول إنشاء بروتوكول لعزل الكريات البيض عن واجهة الأم والجنين ، وأدركنا أن الطرق المنشورة لم تسهل عزل الخلايا المناعية النادرة التي تهمنا.

مظاهرة سيتم تنفيذ الإجراء بواسطة Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez ، وهم باحثون مشاركون من مختبري لجمع أنسجة واجهة الأم الجنينية ، ابدأ باستخدام زوج من المقص الجراحي المعقم لإزالة الجزء السفلي من البطن من الجلد والأنسجة العضلية تماما. بعد ذلك ، استخدم الملقط لتحريك جميع الأعضاء الأخرى جانبا حتى يظهر الرحم والمبيضين. ثم حرك الرحم خارج التجويف البريتوني.

حدد موقع المبايض البعيدة عن UCT والوصلة الأنبوبية الرحمية لكل قرن رحمي. ثم قم بعمل شق عند تقاطع البوق الرحمي لفصل القرون عن المساريق الذي يحتوي على أوعية الرحم. استئصال عنق الرحم لفصل قرون الرحم عن التجويف البريتوني.

ثم استخدم المقص الجراحي لعمل شق بين عنق الرحم والجزء السفلي من القرون ، مع ترك جزء من عنق الرحم متصلا لتجنب فتح قرن الرحم. اغمر القرون وعنق الرحم في طبق بتري كبير مليء ب 10 إلى 15 مل من PBS لترطيب مواقع الزرع. تقليم أي دهون من الأنسجة.

ثم أمسك القرون في مكانها بالملقط. قم بعمل قطع عرضي عبر منطقة الزرع لإزالة أحد مواقع الزرع من الرحم. الآن أمسك الموقع في مكانه وقم بعمل شق صغير في جدار الرحم المجاور للأنسجة المشيمية والأنسجة المتبقية.

تقليم محيط المشيمة والديسيدوا حتى تنفصل الأنسجة عن كل من جدار الرحم والغشاء المشيمي. ثم انقل المشيمة والأنسجة المتصلة إلى طبق بتري طازج يحتوي على ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من PBS. انقل الجنين إلى طبق بتري آخر مع PBS واستخدم ملاقط ذات أطراف رفيعة لتقشير الأنسجة الرمادية البيضاء برفق من سطح المشيمة.

الحرص على الحفاظ على سلامة أنسجة المشيمة وأنسجة ECI. قسم أنسجة المشيمة وأنسجة ECI إلى طبقين من بتري مسمى بشكل فردي مليء ب PBS. ثم استخدم الملقط ذو الطرف الناعم لإزالة جدار الرحم برفق لغشاء chorio Allen toic ووضع أنسجة الرحم هذه في طبق بتري جديد مليء ب PBS لفصل الأنسجة ميكانيكيا.

بعد ذلك ، انقل اثنين من 100 إلى 150 ملليغرام من أنسجة القرص الرحمي والمشيمة وقم بتسمية أنبوبين مخروطيين مليلترين بشكل فردي. أضف 500 ميكرولتر من المحلول الأنزيمي البارد واحدا لكل أنبوب. ثم استخدم مقصا معقما لفصل كل من الأنسجة ميكانيكيا لمدة لا تزيد عن دقيقتين حتى التعليق.

تطوير مظهر حليبي. أضف 500 ميكرولتر إضافي من المحلول الأنزيمي البارد ، واحد لكل أنبوب ، وضع الأنابيب على الجليد. ثم احتضان جميع الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع تحريك مداري لطيف عند 80 دورة في الدقيقة ، ووضع الأنابيب على الجليد بعد 30 إلى 35 دقيقة لوقف الهضم.

الآن قم بتصفية كل ملاط أنسجة من خلال مصفاة 100 ميكرون في أنابيب مخروطية سعة 50 ملليلتر مسمى بشكل فردي ، واغسل كل أنبوب مليلتر ومصفاة مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام 20 مل من PBS لجمع جميع الخلايا. عندما يتم تصفية جميع الخلايا ، قم بتدويرها لأسفل وشفط SUP natin بعناية دون إزعاج الكريات. قم بتعليق الكريات البيض المعزولة والخلايا اللحمية برفق في مليلتر واحد من ثقافة RPMI ، متوسطة بدون دوامة.

ثم لكل نسيج ، أضف 500 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية في أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر وقم بتراكب معلق الخلية ببطء على المصل. أخيرا ، عندما يتم تراكب جميع الخلايا ، فإن خلايا أجهزة الطرد المركزي دون انقطاع واستنشاق النيران دون لمس كريات الخلية. في هذه الصور ، تم عزل مورفولوجيا F أربعة 80 بلاعم إيجابية من أنسجة القروض والرحم.

في 16.5 يوما بعد الموت تظهر خلايا من أنسجة واجهة الأم والجنين. تظهر قابلية للحياة أكثر من 70٪ بعد العزل بهذه الطريقة وتحتوي على البلاعم العدلات والخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية ومجموعات الخلايا المتغصنة مع نسبة عالية من البلاعم التي تعبر عن مجموعات صغيرة من كريات البيض CD 11 C معزولة من الأنسجة في المرآة وواجهة الأم الجنينية. تشمل أيضا الخلايا البائية والقرص المضغوط أربع خلايا تائية موجبة ، وثمانية خلايا تائية موجبة للقرص المضغوط ، وثلاثة خلايا تائية موجبة ، وأربعة خلايا تائية سلبية ، وثمانية خلايا تائية سالبة معزولة أيضا كما لوحظ في مخطط الكثافة هذا.

حسنا ، أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بالأنسجة وكوكتيل الإنزيم على الجليد لضبط درجة الحرارة الصحيحة في الحاضنة وعدم الإفراط في التلاعب بأنسجتك أثناء الهضم بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التنميط المناعي وزراعة الخلايا وفرز الخلايا وعزل D-N-A-R-N-A. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الكريات البيض المتسللة في واجهة الأم والجنين والرحم والمشيمة.