قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير وفحص الخصائص الفيزيائية لأغشية فصل الطور باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق خلط ديليو أولا ، فوسفاتيديل كولين ، FGO ، المايلين ، والكوليسترول بنسبة اثنين إلى اثنين إلى واحد لتشكيل مرحلة فصل خليط الدهون. بعد ذلك ، يتم تحضير الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة عن طريق ترسيب معلق الجسيمات الشحمية في سطح MICA باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية.

ثم يتم مسح سطح الطبقة الثنائية ضوئيا، مما ينتج عنه صورة طبوغرافية حيث يمكن قياس السمات الهيكلية مثل الارتفاع. يتم إجراء التحليل الطيفي للقوة التالية على مناطق محددة من الطبقة الثنائية لاستكشاف الخصائص الفيزيائية للطبقة الثنائية ، وأبرزها قوة الاختراق وسمك الغشاء. في النهاية ، تظهر النتائج اختلافات في الخصائص بين مراحل الدهون المختلفة بناء على صور FM ومنحنيات القوة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري الفلوري ، هي زيادة الدقة والخصائص الإضافية التي يمكن أن يفحصها FM على العينة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الفيزياء الحيوية ، مثل بنية الأغشية البيولوجية والبروتينات المضمنة في هذه الأغشية. علاوة على ذلك ، يمكننا أيضا إلقاء نظرة على الخصائص الفيزيائية للغشاء ومراقبة كيف يمكن للتغيرات في تكوين أو العوامل النشطة الإضافية للغشاء تغيير هذه الخصائص.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الطبيعة الهشة للعينة. هذا له آثار على تحضير العينة ، والتعامل مع اختيار الكابولي والتصوير FM وظروف التحليل الطيفي ابدأ بإذابة DOPC ، والسبينو ، والمايلين والكوليسترول في الكلوروفورم بالتركيزات المطلوبة. ثم امزج 18.38 ميكرولتر من DOPC و 17.1 ميكرولتر من المايلين الغنائي و 11.3 ميكرولتر من الكوليسترول لعمل محلول يحتوي على ملليغرام واحد من إجمالي الدهون ونسبة مولية من اثنين إلى اثنين إلى واحد على التوالي.

امزج المحلول عن طريق الدوامة ، وجفف الخليط باستخدام غاز خامل مثل النيتروجين ، ثم جففه أكثر تحت الفراغ لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بإذابة الدهون المجففة في 100 ميكرولتر من PBS بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر. دوامة للخلط بقوة لمدة دقيقة تقريبا.

للحصول على تعليق غائم يحتوي على حويصلات رقائقية متعددة. تأكد من عدم ترك أي أغشية دهنية متصلة بجوانب القارورة. خذ 10 ميكرولترات من معلق الدهون الرقائقي المتعدد وأضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم.

ثم امزج المحلول وانقله إلى قارورة زجاجية صغيرة مغطى بسعة ملليلتر وأغلقها بصوت بارا فيلم. الخليط في درجة حرارة الغرفة في الحمام صوتنة لمدة 10 دقائق. خلال هذا الوقت ، يجب أن يصبح المحلول واضحا وسينتج عنه أحادي صغير أو حويصلات يبلغ قطرها حوالي 50 نانومتر.

اغسل الغطاء الزجاجي في الماء متبوعا بالإيثانول ، ثم اتركه حتى يجف في الهواء. بعد ذلك ، خذ أقراص Micah وانزع الطبقة الخارجية باستخدام شريط لاصق. قم بتوصيل قرص MICA بزلة غطاء باستخدام قطرة من الغراء الشفاف بصريا.

ثم قم بتوصيل الأسطوانات البلاستيكية ب MICA باستخدام الشحم المفرغ وتأكد من عدم وجود تسرب. ضع محلول الجسيمات الشحمية بالكامل مباشرة على الميكا وأضف 140 ميكرولترا إضافيا من الطبقة الدهنية المدعومة للوصول إلى حجم 300 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 0.9 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم المولي للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ ثلاثة ملليمولار من الكالسيوم ، واحتضان العينات لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية ، ثم لمدة 10 دقائق على الأقل عند 65 درجة مئوية خلال هذه الخطوة ، قم أيضا بتسخين المخزن المؤقت للطبقة الدهنية المزدوجة المدعوم إلى 65 درجة مئوية.

أضف المخزن المؤقت إذا لزم الأمر لضمان عدم جفاف العينة. سيؤدي تغطية غرفة العينة بقلة غطاء إلى الحفاظ على رطوبة العينة. ثم اشطف العينة برفق باستخدام الدهون المدعومة مسبقا بطبقة عازلة من 10 إلى 15 مرة لإزالة الكالسيوم والحويصلات غير المدمجة.

توخي الحذر الشديد أثناء خطوات الغسيل لمنع الطبقة الثنائية من الجفاف باتباع خطوات الغسيل. قم بتبريد الطبقات الثنائية المدعومة إلى درجة حرارة الغرفة. قبل القياسات على مجهر القوة الذرية ، قم بإعداد مجهر القوة الذرية أو FM لإجراء تصوير للطبقات الدهنية الثنائية في المحلول.

باستخدام وضع التلامس وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ، أضف المخزن المؤقت إلى العينة لإبقائها مغمورة في المخزن المؤقت أثناء التجربة بأكملها. قم بتركيب العينة على مرحلة A FM وتأكد من تشغيل جميع وحدات عزل الاهتزاز. انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى يتوازن النظام ويقلل من الانجراف الحراري.

بعد ذلك ، اقترب من العينة في وضع التلامس بطرف ناتئ FM ناعم حتى يتم الاتصال. نظرا لأن الطبقات الثنائية هشة للغاية ، قلل من نقطة ضبط طرف A FM أثناء تصوير وضع التلامس للحفاظ على القوة عند الحد الأدنى وتصحيح الانجراف الحراري مع الحفاظ على ملامسة العينة. بمجرد اكتمال التصوير ، قم بمعالجة الصور عن طريق تركيب كل خط مسح ضوئي لوظائف التسوية متعددة الحدود.

قم بإزالة الخط لعمليات المسح التي تفقد الاتصال بالغشاء. باستخدام البرنامج الاحتكاري لشركة تصنيع FM ، قم بمعايرة الكابولي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة من أجل تحديد التحويل الصحيح للإشارة الكهربائية إلى قياس القوة. بعد تصوير منطقة من الطبقة الثنائية ، حدد منطقة خمسة ميكرون في خمسة ميكرون في الطبقة الثنائية لإجراء التحليل الطيفي للقوة.

قم بإعداد AFMs بحيث يأخذ منحنيات القوة في شبكة 16 × 16 لتلك المنطقة ، مما ينتج عنه 256 منحنى قوة لكل منطقة. ثم قم بإعداد إزاحة Z piso إلى 400 نانومتر. يحدد هذا الحد الأقصى لنطاق حركة z piezo ويضمن أن الكابول قد تراجع تماما عن العينة بين القياسات.

بعد ذلك ، قم بتعيين سرعة الاقتراب إلى 800 نانومتر في الثانية وسرعة التراجع إلى 200 نانومتر في الثانية. قم أيضا بتعيين القوة المستهدفة القصوى لكل منحنى قوة في هذه الحالة ، 12 نانو نيوتن. بعد إعداد جميع المعلمات ، احصل على منحنيات القوة بالضغط على زر التشغيل الخاص ببرنامج A FM.

احصل على ما لا يقل عن 500 منحنى قوة لكل شرط لضمان إحصائيات جيدة ، ورسم رسم بياني للقيم ثم قم بملاءمة الرسوم البيانية مع التوزيع الغوسي من أجل الحصول على ذروة وعرض التوزيع. بسبب تكوين الدهون باستخدام هذه الدراسة ، يتم تشكيل منطقتين رئيسيتين للغشاء. هناك منطقة سائلة مرتبة تتكون من الغذاء والمايلين والكوليسترول ، ومنطقة سائلة مضطربة تتكون بشكل أساسي من DOPC.

يمكن أن يوفر ملف تعريف الارتفاع من تصوير A FM معلومات مهمة عن بنية الغشاء من خلال النظر إلى ملف تعريف الارتفاع. يمكن قياس سمك الطبقة الثنائية من خلال الاستفادة من وجود عيوب في الغشاء. يمكن أيضا استخدام خريطة الارتفاع لقياس الفرق في الارتفاع بين المراحل المرتبة والمضطربة.

تستخدم منحنيات القوة المشتقة من وضع التحليل الطيفي للقوة لقياس قوة الاختراق عن طريق تحديد قيمة القوة في ذروة منحنى القوة كما هو موضح هنا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اشتقاق سمك الغشاء عن طريق طرح قيمة المسافة من ذروة منحنى القوة إلى قيمة المسافة. عندما يبدأ منحنى القوة في الارتفاع مرة أخرى ، أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على محلول الطبقات B ومراقبة تجميع FM باستمرار لتصحيح تأثيرات الانجراف الحراري وتراكم D على الحافة باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ديناميكيات الغشاء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحضير المدعوم بالطبقات واستخدام FM لتصوير الخصائص الفيزيائية لهذه الطبقات الثنائية والتحقيق فيها.