تنفيذ في المختبر المخدرات المقاومة فحوصات: تعظيم إمكانات لكشف آليات المقاومة ذات الصلة سريريا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسهيل الاكتشاف قبل السريري السريع لمتغيرات النيوكليوتيدات المفردة ذات الصلة سريريا والتي قد تؤدي وظيفيا إلى مقاومة فئات مختلفة من العلاجات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأورام ، مثل الطفرات الجينية التي قد تساهم في المقاومة الوظيفية للعلاجات في العيادة والتي قد توجه في النهاية التحسين في العلاجات واستراتيجيات الإدارة السريرية البديلة للمرضى المقاومين للأدوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نسهل ظهور الطفرات العفوية ونطبق تقنية فحص غير متحيزة في المستنسخة المقاومة ، فهناك احتمال أكبر أن تؤدي هذه المتغيرات إلى العلاجات المستهدفة للانتكاسة في العيادة.

إظهار الإجراء باحثا موهوبا جدا من مختبري لتقييم GI 50 لخطوط الخلايا. قم بإعداد لوحة فحص عن طريق بذر الخلايا في شفاف غير شفاف. أسفل 96 لوحة بئر في 100 ميكرولتر من وسط الخلية وفقا للخريطة الموضحة هنا.

قم بإعداد لوحة تحكم بطريقة مماثلة ، مع إضافة خلايا إلى الآبار الزرقاء ومتوسطة فقط إلى الآبار البيضاء. بعد احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية طوال الليل ، قم بموازنة كاشف صلاحية الخلية المضيئة إلى درجة حرارة الغرفة واخلطه برفق عن طريق قلبه. للحصول على محلول متجانس ، أضف 80 ميكرولترا من الكاشف إلى آبار لوحة التحكم وقم بهز المحتويات لمدة 30 دقيقة.

للحث على تحلل الخلايا. استخدم مقياس إضاءة مع تعريض ضوئي من 0.1 إلى 1.0 ثانية وطول موجة للكشف 560 نانومتر لتسجيل اللمعان. بعد ذلك ، لإضافة مركبات الاختبار إلى لوحات الفحص ، قم بعمل سلسلة من واحد من كل أربعة من المركبات في DMSO بدءا من تركيز 2000 ميكرومولار ليصبح المجموع 10 تخفيفا.

ثم أضف المركبات المخففة متسلسلا إلى متوسطة لعمل مزيج متوسط مركب بتركيز نهائي 10 ×. قم بتخزين اللوحة المركبة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في اليوم الثالث من الفحص. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من المركبات المخففة إلى الخلايا في ثلاث نسخ بحيث تكون الجرعة الأعلى 10 ميكرومولار.

احتضن الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. في اليوم الثالث ، قم بإعداد مزيج متوسط مركب سعة 400 ميكرولتر واحد X باستخدام الألواح المركبة المحضرة قبل ثلاثة أيام. اقلب ألواح الفحص لإزالة الوسط واتركها حتى تجف على مناشف الأوتوكلاف الورقية مرتين إلى ثلاث مرات.

أضف مركبا واحدا إلى مظلل جيدا باللون الأزرق وأضف 100 ميكرولتر من الآبار المتوسطة إلى المحيطة لمنع التبخر. في اليوم السادس ، قم بتقييم العدد النسبي للخلايا القابلة للحياة عن طريق أخذ قراءة التلألؤ كما هو موضح سابقا في الفيديو. ثم احسب قيم GI 50 باستخدام برنامج مثل PRISM باستخدام قيم GI 50 المحسوبة التي تم إعداد الخلايا لمقايسات مقاومة الأدوية.

في حالة العمل مع عامل تثبيط الخلايا ، فإن خلايا البذور عند التقاء 30 إلى 40٪ في أطباق استزراع 150 ملم مربع. إذا كنت تعمل مع عامل سام ، فراجع الخلايا عند التقاء 70 إلى 80٪. بعد تحديد تركيزات المركبات الأولية وفقا لبروتوكول النص ، عالج الخلايا بمركبات الاختبار للمركبات شديدة السمية ، والتي تسبب موت الخلايا في اختبار الجدوى لمدة ستة أيام.

ابدأ بمؤشر الجلائم الجلايسيمي 50 وقم بزيادة التركيز بشكل تدريجي كل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع حتى يتم ملاحظة مقاومة قوية. لعزل المستنسخة أحادية الخلية ، استخدم الفحص المجهري لتباين الطور عند تكبير 40 × لفحص طبق الثقافة وتحديد مجموعات الخلايا القابلة للحياة في قاع الطبق. استخدم قلما لتمييز المستنسخة ذات الحجم المتوسط والمعزولة جيدا عن المستعمرات الأخرى لاختيار المستنسخة باستخدام ماصة P 200.

قم بإزالة وسط النمو من الطبق واستخدم XPBS لشطف أي خلايا عائمة. باستخدام طرف الماصة ، ارفع المستنسخة وانقلها إلى آبار صفيحة 48 بئرا تحتوي على 50 ميكرولترا من 0.25٪ تحتضن التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ثم أضف 200 ميكرولتر من الوسط الطازج مع نصف تركيز المركب للسماح بالتعافي الأمثل للخلايا.

لعزل المستنسخة باستخدام أقراص استنساخ بثلاثة ملليمترات ، ضع الأقراص في طبق زراعة أنسجة بحجم 10 سم يحتوي على خمسة ملليلتر من 0.25٪ تريبسفي EDTA لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بشفط الوسط من الطبق الذي يحتوي على المستنسخة المقاومة وتراكب المستنسخة مع الرحلات وأقراص الاستنساخ المنقوعة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين اعتمادا على مدى سهولة رفع المستنسخة عن الألواح.

ثم باستخدام ملقط معقم ، التقط أقراص الاستنساخ وانقلها إلى 48 لوحة بئر مع 200 ميكرولتر من الوسط الطازج ، واحصل على تركيز الماصة المركبة بلطف لأعلى ولأسفل لإخراج الخلايا من أقراص الاستنساخ واحتضانها عند 37 درجة بين عشية وضحاها في اليوم التالي ، وإزالة أقراص الاستنساخ ، واحتضان الخلايا ، ثم تقييم مقاومة الأدوية. وفقا لبروتوكول النص ، كما هو موضح هنا ، عولجت HCT 16 خلية لفترة طويلة بالسمية للخلايا. أدى المركب رقم واحد إلى الظهور التلقائي للنسخ المقاومة التي استمرت في النمو أثناء العلاج.

تم اختيار المستنسخة باستخدام رجل ماصة. في هذا الشكل ، أظهرت المستنسخة المقاومة من واحد إلى ثلاثة مقاومة كبيرة للمركب رقم واحد ، ومركب تناظري وثيق رقم اثنين ، بينما أظهرت جميع المستنسخة حساسية لمركب سام للخلايا غير ذي صلة. فيلكيد. بعد تأكيد مقاومة النمط الظاهري ، تم عزل GDNA وتقديمه لتحليل تسلسل الإكسوم بالكامل.

تم تأكيد المتغيرات الهيكلية المتكررة والتي لديها القدرة على التأثير الوظيفي من خلال أداة تسلسل مستقلة مثل تسلسل سانجر. كان المثال الموضح هنا يحمل طفرة خاطئة متغايرة الزيجوت ، وتم تصميم خط الخلية الأبوية لاحقا للتعبير عن CDNA المتحور. في حين أن الإفراط في التعبير عن النوع البري CDNA فشل في منح مقاومة للأدوية.

CD NA المتحولة بشكل كبير مقاومة النمط الظاهري للمركب رقم واحد ، مما يؤكد الدور الوظيفي للتباين الهيكلي كمحرك للمقاومة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير نمو مقاوم تلقائي للكشف عن الجينات المسؤولة عن مقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية بعد تطورها. تأخذ هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأورام لاستكشاف آليات مقاومة الأدوية بطريقة غير متحيزة في كل من خطوط الخلايا السرطانية والنماذج الحيوانية.