إنشاء ذات الصلة سريريا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج ذي صلة سريرياً حيث يمكن تتبع إصلاح الجروح في بيئتها الدقيقة الأصلية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة العدسة من عين جنين الدجاج. وتتمثل الخطوة الثانية في إجراء شق صغير في الجزء الأمامي من العدسة.

بعد ذلك، يتم شطف كتلة خلايا ألياف العدسة مائياً. ثم يتم بسط محفظة العدسة مع الظهارة المرتبطة بها عن طريق إجراء شقوق إضافية في المحفظة الأمامية. وتتمثل الخطوة النهائية في تثبيت المزرعة المصابة في طبق زراعة الأنسجة من أجل متابعة التئام الجرح أثناء حدوثه.

في النهاية، يُستخدم المجهر الزمني (time-lapse microscopy)، والمجهر البؤري (confocal microscopy)، والتحليل البيوكيميائي لإظهار آليات إصلاح الجروح في نموذج يحاكي بدقة البيئة الحية (in vivo). يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التئام الجروح، مثل كيفية تحرك الخلايا بشكل منسق معاً لإغلاق الجرح. وعلى الرغم من ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن تقدم رؤية متعمقة حول عملية إصلاح الجروح.

ويمكن تطبيق ذلك أيضاً في دراسات التئام جروح ABER، ولا سيما التليف والتندب. ابدأ بوضع ثلاثة أطباق بتري بقطر 100 millimeter في غطاء تدفق صفائحي معقم. املأ طبقين من أطباق بتري حتى المنتصف بمحلول tris dextrose buffer في درجة حرارة الغرفة، واترك الطبق الثالث فارغاً.

بعد ذلك، أخرج بيضة دجاج "ليغهورن" بيضاء مخصبة في اليوم الجنيني 15 من الحاضنة عند درجة حرارة 37.7 °C، وقم بتنظيف السطح الخارجي للقشرة باستخدام 70% ethanol لتعقيمها. بعد ذلك، قم بكسر البيضة بعناية وضع محتوياتها في طبق بتري فارغ مقاس 100 millimeter. وباستخدام ملاقط قياسية ومقص دقيق، قم بفصل رأس الجنين ووضعه في أحد الأطباق التي تحتوي على TST dextrose buffer.

خلال 15 دقيقة، انقل رأس جنين الدجاج إلى غطاء طبق بتري. استخدم ملقطاً عالي الدقة لقرص الجزء الخلفي من العين، مما يؤدي إلى إحداث فتحة صغيرة في الجزء الخلفي منها. بعد ذلك، أمسك بالخلط الزجاجي باستخدام الملقط واسحبه برفق بحركة دائرية.

سوف ينفصل الجسم الزجاجي مع العدسة الملحقة به عن العين. ضع العدسة والجسم الزجاجي في طبق بتري المتبقي الذي يحتوي على Tex extras Buffer. اترك العدسات في المحلول المنظم لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة قبل المتابعة في عملية التشريح.

بعد ذلك، انقل العدسة إلى غطاء طبق بتري جديد تحت مجهر تشريحي باستخدام ملاقط دقيقة للغاية، وقم بإزالة أي خلايا من الجسم الهدبي قد تكون انزاحت مع العدسة بعناية باستخدام حافة الملاقط. ثم افصل العدسة عن الخلط الزجاجي عن طريق قطع الجسم الزجاجي من ارتباطه بمحفظة العدسة الخلفية. وبمجرد الفصل، انقل العدسة إلى قطرة بحجم 200 microliter من منظم تريس ديكستروز في طبق زراعة أنسجة بقطر 35 millimeter، ووجهها بحيث يكون الجانب الأمامي للعدسة متجهاً للأعلى.

يمكن التعرف بسهولة على الجزء الأمامي من العدسة من خلال وجود حلقة كثيفة في النسيج تحدد الحدود بين المنطقة الداخلية والمنطقة الاستوائية لظهارة العدسة. باستخدام ملقطين عاليي الدقة، قم بإجراء شق صغير بطول 850 microns تقريبًا في مركز المحفظة الأمامية للعدسة عن طريق الإمساك بالنسيج بملقط في كل يد والشد برفق في اتجاهين متعاكسين. بعد ذلك، أحضر سرنجة سعة 1 milliliter مع طرف إبرة بقياس 27.5 gauge واملأها بـ 300 µL من TST dextrose buffer.

أدخل طرف الإبرة في الشق الموجود في المحفظة الأمامية للعدسة وصولاً إلى منتصف العدسة تقريباً. ثم اضغط برفق على المحقنة لحقن محلول TST dextrose المنظم داخل العدسة. كتلة الخلايا الليفية.

احقن ما بين 50 و 200 µL من المحلول المنظم لفصل كتلة الخلايا الليفية عن الظهارة المحيطة ومحفظة العدسة. لا تحقن أبدًا أكثر من 300 µL. وباستخدام ملقط عالي الدقة، قم بإزالة كتلة الخلايا الليفية المفككة من العدسة عبر موقع الشق الأمامي.

يؤدي إزالة كتلة الخلايا الليفية من مكان التصاقها بالمحفظة الخلفية إلى إنشاء منطقة جرح قابلة للتكرار بدرجة عالية على الغشاء القاعدي، محاطة بالظهارة المجروحة. وبدءاً من الكيس المحفظي، قم بإجراء خمسة شقوق في الجانب الأمامي للعدسة وصولاً إلى خط الاستواء. ثم قم ببسط الشريحات الخمس الناتجة من محفظة العدسة مع الظهارة الملتصقة بها على طبق الزرع، بحيث يكون جانب المحفظة للأسفل وجانب الخلايا للأعلى.

اضغط برفق باستخدام الملقط عند كل نقطة من نقاط النجمة لتثبيت الكبسولة في الطبق. سيؤدي ذلك إلى إحداث انبعاج صغير عند الأطراف الخمسة الخارجية لـ x explan، مما ينتج عنه التصاق مستدام بالطبق. بعد ذلك، قم بإزالة محلول tris dextrose buffer من الطبق الذي قطره 35 مليمتر واستبدله بـ 1.5 milliliters من M1 99 الدافئ مسبقاً.

أوساط زراعية مدعمة بـ 1% من كل من L-glutamine والبنسلين والستريبتومايسين. يتم تغطية الطبق بغطائه ووضعه في الحاضنة. يوضع طبق المزرعة تحت المجهر التشريحي وملاحظة الخط الفاصل بين منطقة الهجرة المركزية ومنطقة الالتصاق الأصلية للخلايا الظهارية.

بعد ذلك، استخدم ملقطين عاليي الدقة للإمساك بحافة كلا الجانبين من خط الترسيم بين المنطقتين. اسحب منطقة الالتصاق الأصلية برفق على طول الخط لفصل المنطقتين بسهولة. استمر في فصل المنطقتين حول المزرعة بأكملها حتى يتم فصل المنطقتين تماماً.

ادرس الكسرين باستخدام تقنيات التحليل الجزيئي أو الكيميائية الحيوية القياسية. فور إزالة كتلة الخلايا الليفية، يتم تنشيط مجموعة فرعية من الخلايا الميزنكيمية للإصلاح الغنية بـ ment وتهاجر إلى حافة الجرح في الظهارة. تنتقل هذه الخلايا بسرعة إلى المنطقة الخالية من الخلايا في كبسولة الغشاء القاعدي الداخلي، وهي منطقة الهجرة المركزية لبدء عملية الالتئام.

إن الجرح، والتقنية الموصوفة هنا تجهز هذا النظام النموذجي بشكل مثالي لمراقبة هذه العملية باستخدام المجهر أو كاميرا الفيديو، حيث يتقدم التئام الجرح بسرعة ليغطي مساحة كبيرة من الجرح بحلول اليوم الأول في المزرعة. وبحلول اليوم الثالث، تكتمل عملية التئام الجرح عادةً بعد انفصال منطقة الهجرة المركزية ومناطق الالتصاق الأصلية. وقد جرى تحليل الاختلافات الجزيئية بين هذه المناطق المتميزة هنا.

تم قياس مستويات كيناز الالتصاق البؤري في المنطقتين، ووُجد أن كمية كيناز الالتصاق البؤري المفسفر قد ازدادت في منطقة الهجرة المركزية المتخصصة في الهجرة. وبمجرد إتقان هذه التقنية لمحاكاة جراحة الساد، يمكن إكمالها في غضون ثلاث دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نموذج محاكاة لجراحة الساد يحاكي بدقة إصلاح الجروح في بيئة دقيقة طبيعية.