Name: فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: تعلم بروتوكولاً مبسطاً لكشف Integrons من الفئة 1 وكاسيتات الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في الأغذية باستخدام PCR وتسلسل الحمض النووي. يتيح هذا الأسلوب رصد انتشار المقاومة عبر سلسلة الغذاء.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بفضل قاعة ميكايلا، لاريسا بيسبو وغوستافو تافاريس للمساعدة التقنية.

<ol><li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li>
<li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li>
<li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+is+ancient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome%2C+mobilome+and+microbial+pangenome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4(2013).</li>
<li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li>
<li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li>
<li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrons%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li>
<li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li>
<li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li>
<li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865(2014).</li>
<li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+wild%3A+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017(2013).</li>
<li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+flow%2C+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li>
<li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li>
<li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+systems%3A+maintaining%2C+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22TREE%22%5BJournal%5D)">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li>
<li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li>
<li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Call+of+the+wild%3A+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li>
<li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li>
<li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li>
<li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li>
<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما ذات الصلة في الكشف عنها.

تحديد integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها قد يمثل خطوة رئيسية في توقع ظهور مسببات الأمراض الانتهازية الجديدة، وتتبع مسارات لمسببات الأمراض في السلسلة الغذائية للإنسان، وتحديد مقاومة جديدة والفوعة محددات 8،21،26. وكان الهدف من هذه الورقة لوصف نهج مبسط لفحص عينات لفئة 1 integrons، واصفا صفائف كاسيت والتعرف على الأنواع البكتيرية التي يقيمون فيها. الخطوات الحاسمة في البروتوكول تنطوي على ممارسة الميكروبيولوجية جيدة، ومنع التلوث PCR التي من شأنها أن تولد ايجابيات كاذبة. </p...

كان اكتشاف المضادات الحيوية واحدة من أعظم الإنجازات العلمية في القرن التاسع 20. ومع ذلك، فقد أدى استخدام وإساءة استخدام المضادات الحيوية لتطور السريع للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، وهذه تشكل الآن تهديدا خطيرا للصحة العامة في القرن الحادي و21. صعود سلالات بكتيرية مقاومة لمعظم خيارات العلاج يزيد من احتمال أننا ندخل عصر حيث العقاقير المضادة للميكروبات لم تعد فعالة 1،2. الآلية الوراثية التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية هو نظام القديم، سبقت البشر والضغوط اختيار المضادات الحيوية من قبل الملايين من 3 سنوات. العناصر الجينية المحمولة، مثل البلازميدات والترانسبوزونات والجزر الجينومية والعناصر وintegrons اقترانية التكاملية يمكن نشر الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (ARG) داخل وبين الأنواع البكتيرية 4 على حد سواء. من هذه، وقد لعبت integrons دورا مركزيا في انتشار ARG، على الرغم منحقيقة أنها تعتمد على البلازميدات والترانسبوزونات للتعبئة والإدراج في الجينوم البكتيري 5. Integrons التقاط أشرطة الجينات باستخدام integron-integrase، ومن ثم التعبير عن أشرطة باستخدام integron المشفرة المروج 6،7 (الشكل 1). Integron الجينات أشرطة عناصر المحمولة الصغيرة التي تتكون من واحد إطارات القراءة المفتوحة (ORF) الذي المنتجات يمكن أن تضفي مقاومة للمضادات الحيوية أو المطهرات 8. الفئة 1 integrons هي integrons تعافى الأكثر شيوعا من العزلات السريرية 5، حيث اكتسبت مجتمعة أكثر من 130 مختلفة أشرطة المقاومة للمضادات الحيوية الجينات 9. انتشار الطبقة 1 integrons إلى المتعايشة والمسببة للأمراض البكتيريا المرتبطة الإنسان يولد تيارات النفايات البشرية التي تحتوي على أعداد كبيرة من هذه العناصر الجينية 10. يتم الافراج يقدر ب 10 19 البكتيريا التي تحتوي على الطبقة 1 integrons عن طريق مياه الصرف الصحي الحمأة كل ط العامن المملكة المتحدة (11). ولذلك ليس من المستغرب أن الطبقة 1 integrons يمنح المقاومة للمضادات الحيوية يجري حاليا الكشف عن الجراثيم في الطيور البرية والأسماك، وغيرها من 12-14 الحياة البرية الوطنية. الإفراج عن integrons مرة أخرى إلى البيئة يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة، منذ اقتناء أشرطة الجينات الجديدة وإعادة ترتيب معقدة مع عناصر المحمولة الأخرى مازالت تحدث، وخاصة في محطات معالجة مياه الصرف الصحي وغيرها من المسطحات المائية 15-18. البيئة الطبيعية ثم يصبح أرضا خصبة لتجنيد محددات مقاومة جديدة ومسببات الأمراض الانتهازية 19،20. يمكن للبكتيريا التي تحتوي على integron جديدة وسائط جديدة دائرة حول العودة الى المجتمع البشري من خلال المياه والأغذية الملوثة 21،22. مراقبة وسائط البيئية هي استراتيجية رئيسية لفهم وإدارة المقاومة للمضادات الحيوية في 23 في المستقبل. على وجه الخصوص، ينبغي إيلاء الانتباه إلى المواد الغذائية التي تؤكل نيئة أوالمطبوخة قليلا، لأن هذه تمثل أكبر تهديد لنقل عناصر متنقلة جديدة ومسببات الأمراض. في هذا البروتوكول، واتباع نهج مبسط للكشف عن، تحديد وتوصيف الدرجة 1 integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها في المواد الغذائية وترد (الشكل 2). باستخدام مزيج من زراعة والبلمرة المتسلسل (PCR)، integrons يمكن الكشف عنها بسرعة في المجتمعات البكتيرية معقدة والعزلات الفردية. وترد أساليب لتحديد الأنواع من البكتيريا والتشكل والهوية من أشرطة الجينات المرتبطة integron. هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من الأطعمة النباتية والحيوانية، ويتم إعطاء أمثلة على سير العمل النموذجية لكل من أنواع الطعام هذه.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>يستخدم في جميع PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (ريبونوكلياز أ من البنكرياس البقري)</td> <td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>يستخدم في جميع PCRs</td></tr><tr><td>إنزيم تقييد HinFI</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>يستخدم لهضم 16S rDNA PCR poducts. يأتي الإنزيم مع عازلة مثالية وسلم BSA</td></tr><tr><td>100 نقطة أساس</td><td>27400701</td><td>GE Healthcare</td><td>يستخدم كمعيار للحجم على جميع المواد الهلامية GelRed</td></tr><tr><td>DNA صبغة</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>تنبيه: يجب ارتداء الحماية الشخصية عند التعامل مع هذه المادة</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>تنبيه: يجب ارتداء الحماية الشخصية عند التعامل مع هذه المادة</td></tr><tr><td>CLS-TC الحل</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>محلول إعادة التعليق المستخدم في بداية استخراج الحمض النووي الجيني</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep أنابيب</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>الأنبوب المطلوب للتعطيل الميكانيكي لجدران الخلايا البكتيرية. يستخدم هذا الرمز لحزم من 500 أنبوب ، وتتوفر كميات أقل.</td></tr><tr><td>مصفوفة ملزمة</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>مخففة 1: 5 مع 6 M جوانيدينيوم ثيوسيانات وتستخدم في طريقة استخراج الحمض النووي الجيني.</td></tr><tr><td>آلة الإعداد السريع</td><td>MP Biomedicals</td><td>عدد الخيارات المتاحة</td> يحتوي <td>MP Biomedicals على عدد من أجهزة FastPrep المتاحة للشراء. قم بزيارة <a href = "http://www.mpbio.com" target = "_blank" >http://www.mpbio.com< / a > لمزيد من المعلومات</td></tr></tbody></table>

فحص المواد الغذائية للفئة 1 integrons وجين كاسيتات

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

مقاومة المضادات الحيوية هي واحدة من أكبر التهديدات للصحةفي القرن الحادي والعشرين. يعد اكتساب جينات المقاومة عن طريق نقل الجينات الجانبية عاملا رئيسيا في انتشار آليات المقاومة المتنوعة. من بين عناصر الحمض النووي التي تسهل النقل الجانبي ، كانت الإنتجرونات من الفئة 1 مسؤولة إلى حد كبير عن نشر محددات مقاومة المضادات الحيوية بين مسببات الأمراض سالبة الجرام. في المجموع ، اكتسبت هذه الإنتجرونات ونشرت أكثر من 130 جينا مختلفا لمقاومة المضادات الحيوية. مع استمرار استخدام المضادات الحيوية ، أصبحت الإنتجرونات من الفئة 1 منتشرة في كل مكان في الأمراض ومسببات الأمراض للإنسان وحيواناتهم المستأنسة. نتيجة لذلك ، يمكن العثور عليها الآن في جميع مجاري النفايات البشرية ، حيث تستمر في اكتساب جينات جديدة ، ولديها القدرة على العودة إلى البشر عبر السلسلة الغذائية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل نهجا مبسطا للكشف عن الإنتجرونات من الفئة 1 وأشرطة جينات المقاومة المرتبطة بها في المواد الغذائية ، باستخدام الزراعة و PCR. باستخدام هذا البروتوكول ، يجب أن يكون الباحثون قادرين على: جمع وإعداد عينات لعمل ثقافات غنية وفحص الإنتجرونات من الفئة 1. عزل المستعمرات البكتيرية المفردة لتحديد العزلات الإيجابية للإنتجرون ؛ تحديد الأنواع البكتيرية التي تحتوي على إنتجرونات من الفئة 1 ؛ وتميز هذه التكامل وأشرطة الجينات المرتبطة بها.

<html> فحص الثقافات المختلطة والعزلات البكتيرية للintI1 مجموعة التمهيدي HS463a / HS464 PCR يمكن استخدامها للكشف عن وجود للintegron integrase الجينات الدرجة 1، intI1 (الشكل 1). هذه المجموعة التمهيدي يعمل بشكل جيد للكشف عن intI1 في الثقافات المختلطة، ويستخدم أيضا لفحص المستعمرات البكتيرية التي تحصد من انتشار لوحات (الشكل 2). يجب أن العزلات الإيجابية تولد فرقة قوية واح...

يصف هذا البروتوكول الكشف عن الإنتجرونات من الفئة 1 وأشرطة الجينات المرتبطة بها في المواد الغذائية.

فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير نهج مبسط للكشف عن integrons من الفئة الأولى وكاسيتات الجينات المرتبطة بها من المواد الغذائية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير مزرعة بكتيرية مثرية من المادة الغذائية المختارة. وتتمثل الخطوة الثانية في فحص المزرعة للكشف عن وجود integrons من الفئة الأولى باستخدام تقنية PCR وعزل مستعمرات مفردة من المزرعة المختلطة الموجبة لـ integrons.بعد فحص المستعمرات المفردة للتحقق من وجود الإنتيجرونات (integrons)، قم بتحضير الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) من المستعمرات المفردة لإجراء تفاعلات البوليميراز المتسلسلة (PCRs) التشخيصية للتمييز بين الأنواع البكتيرية والكشف عن وجود كاسيتات الجينات (gene cassettes). وتتمثل الخطوة النهائية في تنقية نواتج الـ PCR وإرسالها لتحليل تسلسل الحمض النووي (DNA sequence analysis). وفي النهاية، يُستخدم تحليل تسلسل الحمض النووي لتوصيف كاسيتات الجينات داخل إنتيجرون من الفئة الأولى وتحديد الأنواع التي تتواجد فيها.تعد مقاومة المضادات الحيوية واحدة من المشكلات الرئيسية التي تواجه العلاج الطبي في القرن الحادي والعشرين. وتتمثل إحدى الطرق التي يمكننا من خلالها إدارة مقاومة المضادات الحيوية في الكشف عن جينات مقاومة المضادات الحيوية وتتبعها في البيئة، بدءاً من البشر وصولاً إلى البيئة ثم العودة مرة أخرى. سيوضح لك هذا البروتوكول كيفية الكشف عن مقاومة المضادات الحيوية.الجينات الموجودة في المواد الغذائية التي قد نتناولها نيئة أو بمعالجة طفيفة. سيقوم بتقديم هذا الإجراء ليت والدرون، وهو باحث ما بعد الدكتوراه يعمل في مختبري. وتعتبر الأطعمة التي تؤكل نيئة أو مطهوة بشكل خفيف، مثل الفواكه والخضروات والمحاريات، الأكثر إثارة للقلق فيما يتعلق بصحة الإنسان.سيتم هنا عرض تحضير المزارع المخصبة من المأكولات البحرية فقط. يرجى الرجوع إلى نص البروتوكول لتحضير المزارع من الفواكه والخضروات. لتحضير مزرعة مخصبة من المأكولات البحرية، استخدم أولاً ملاقط ومقاص sterile لاستئصال القناة الهضمية من الروبيان.ضع المادة التي تم تشريحها في أنبوب معقم سعة 1.5 milliliter يحتوي على 200 microliters من محلول منظم فوسفات الصوديوم. قم بسحق العينة باستخدام مدقة لتحضير متجانس ثم استخدم جهاز الـ vortex. وزع سريعاً خمسة milliliters من مرق LB في أنبوبين معقمين سعة خمسة milliliters ولقّح كل منهما بالمتجانس المستخلص من المأكولات البحرية.رُج كلا الأنبوبين طوال الليل بسرعة 200 OPM، مع تحضين أحد الأنبوبين عند 25 degrees Celsius والآخر عند 37 degrees Celsius في اليوم التالي. تُخزن المزارع عند four degrees Celsius حتى يحين وقت استعادة مستعمرات مفردة من مزرعة مختلطة موجبة لـ PCR. أولاً، يتم تخفيف المزرعة تسلسلياً بمقدار عشرة أضعاف في محلول منظم من فوسفات الصوديوم عن طريق إضافة one milliliter من المزرعة المختلطة إلى nine milliliters من محلول منظم من فوسفات الصوديوم والمزج باستخدام جهاز vortex.أضف واحد مل من التخفيف إلى تسعة مل أخرى من منظم فوسفات الصوديوم وكرر العملية حتى الوصول إلى تخفيف تسلسلي بمقدار 10⁻⁸. قم بنشر 100 µL من التخفيفات من 10⁻⁴ إلى 10⁻⁸ للمزرعة المخففة على وسط LB agar. وبشكل مكرر، قم بحضن الأطباق طوال الليل في درجة الحرارة نفسها المستخدمة للمزرعة المختلطة الأولية في اليوم التالي.يمكن اختيار مستعمرات فردية من أطباق التخفيف المتسلسل. ولتحضير الـ DNA، تأكد من وضع ملصقات واضحة على جميع الأطباق وأنابيب العينات قبل البدء. المس مستعمرة فردية بعود أسنان معقم، ثم انقلها إلى أنبوب PCR يحتوي على 100 µL من الماء المعقم.قم بتدوير عود الأسنان بين الأصابع لفصل بعض الخلايا في الماء، وباستخدام عود الأسنان نفسه، قم بتلقيح طبق LB عن طريق تخطيط كل مستعمرة تم اختيارها. يمكن تخزين أعداد كبيرة من المستعمرات في أطباق مُصنفة. إذا كان طول كل خط تخطيط حوالي 1 cm، فأغلق الغطاء فوراً للحد من التلوث بين العينات.اختر أكبر عدد ممكن من أنواع المستعمرات المختلفة باستخدام معايير مثل حجم المستعمرة وشكلها ولونها. قم بحضن أطباق LB طوال الليل عند درجة الحرارة نفسها المستخدمة في المزرعة المخصبة الأولية. يمكن بعد ذلك تخزين المزارع عند درجة حرارة أربعة درجات Celsius حتى يحين وقت تحضير DNA من المعلقات البكتيرية.قم بتسخين العينات عند 99 °C لمدة 10 دقائق باستخدام جهاز thermocycler، ثم استخدم جهاز طرد مركزي دقيق (micro centrifuge) بسرعة 14,000 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب حطام الخلايا، ثم أعد العينات إلى الثلج. بعد ذلك، قم بفحص الـ DNA عن طريق الـ PCR باستخدام البادئات HS 4 63 A و HS 4 64. واتباعاً للإجراءات الموضحة في نص البروتوكول، من المهم تجنب أي مصادر محتملة لتلوث الـ DNA عند إجراء الـ PCR لتقييم نتائج التضخيم عن طريق الرحلان الكهربائي (electrophoresis).يتم تحميل 7 µL من كل ناتج PCR على هلام أغاروز بتركيز 2%، تم صبه وتشغيله في محلول TBE المنظم، بعد صبغ الهلام بصبغة DNA. يتم تصور الـ DNA باستخدام جهاز ترانسيلوميناتور UV. ستنتج العزلات التي تحمل إنترغرون من الفئة الأولى حزمة واحدة قوية عند 471 base pairs. يُستخدم الـ DNA الجينومي المحضر من العزلات التي أظهرت نتيجة PCR إيجابية في هذه التحليلات. يتم إذابة الـ DNA الجينومي على الثلج مع استخدام جهاز الفورتيكس لفترة وجيزة، ثم إجراء عملية طرد مركزي نبضية بسرعة 14,000 ×g لمدة 20 ثانية.تظهر تتابعات البادئات وظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المستخدمة في اختبارات الـ PCR التشخيصية في الجدول الأول من المخطوطة. أولاً، كرر تفاعل PCR لجين integrase من الفئة الأولى للتأكيد من أن العزلة موجبة لقطعة التضخيم التي يبلغ طولها 471 base pair. بعد ذلك، حدد المزارع الموجبة على مستوى النوع عن طريق تضخيم جين الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي للوحدة الفرعية الصغيرة 16S-rDNA.يجب أن تنتج جميع الأهداف البكتيرية قطعة مضخمة من 16S بطول يبلغ حوالي 1,450 زوجاً قاعدياً، نظراً لأن العديد من هذه المزارع الإيجابية ستكون متطابقة. يتم تمييز الأنواع البكتيرية المختلفة عن طريق الهضم الإنزيمي لمنتج 16S PCR. يوصى باستخدام إنزيم القطع HIF1 لأنه يحقق تنوعاً جيداً من أهداف 16S وهو إنزيم موثوق وغير مكلف.قم بتحضير مزيج رئيسي للهضم التقييدي بحجم 30 µL في أنبوب معقم، ثم أضف 20 µL من ناتج 16S PCR غير المنقى. يتم التحضين في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C طوال الليل، وفي اليوم التالي، يتم فحص عملية الهضم باستخدام هلام Agarose بتركيز 2%. يتم بعد ذلك تنقية نواتج 16S PCR المختارة باستخدام طقم تجاري وإرسالها إلى مرفق تسلسل الحمض النووي لإجراء تسلسل DNA. استخدم تسلسل DNA الناتج للبحث في قاعدة بيانات NCBI DNA باستخدام وظيفة Blast N، حيث تُعتبر نسبة تطابق النيوكليوتيدات التي تزيد عن 97% عادةً دليلاً على تطابق النوع.يتم فحص المزارع المختلطة من العزلات المضادة للبكتيريا للكشف عن وجود جين الإنتجريز من الفئة الأولى بواسطة تقنية PCR. وباستخدام البادئات HS 4 63 A و HS 4 64، تُنتج المستعمرات الإيجابية حزمة واحدة قوية عند 471 base pairs. ويُستخدم الحمض النووي الجينومي (Genomic DNA) من العزلات النقية لتوصيف مصفوفات الكاسيت البينية، حيث يؤدي تضخيم مصفوفات الكاسيت من إنتيجرونات TN 4 0 2 باستخدام البادئات HS 4 58 و HS 4 59 إلى إنتاج أحجام نواتج متغيرة تعتمد على هوية وحجم الكاسيتات المكونة للمصفوفة.يتطلب تحديد هوية هذه الكاسيتات إجراء تسلسل للحمض النووي DNA. غالبًا ما تكون إنتيغرونات الفئة البيئية الأولى (Environmental Class one integrons) مدمجة في الكروموسومات البكتيرية. ويمكن تضخيم مصفوفاتها باستخدام البادئات MG 2 84 وMG 2 85 التي تستهدف مواقع إعادة التركيب القريبة والأكثر بُعدًا على التوالي. كما ينتج عن تفاعل PCR هذا أحجام منتجات متغيرة تعتمد على هوية وحجم الكاسيتات المكونة للمصفوفة.ومع ذلك، فمن غير المرجح أن تقوم الكاسيتات في المصفوفات البيئية بتشفير مقاومة المضادات الحيوية. يتم تحديد الأنواع البكتيرية عن طريق تضخيم 16 S-R-D-N-A وفحص نواتج PCR عن طريق الهضم. وباستخدام HIF، سينتج نوع فردي واحد أنماطاً مميزة بحيث يمكن تحديد عزلات النوع نفسه وتأكيدها بسهولة عن طريق تسلسل DNA.بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن تكون لديك الآن فكرة جيدة عن كيفية عزل الإنتجرونات (integrons) من الفئة الأولى وكاسيتات مقاومة المضادات الحيوية الخاصة بها من الأطعمة اليومية.

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

JoVE Journal

Environment

البيئة

ووصف طريقة سريعة وفعالة لدمج الحمض النووي الأجنبية ذات الاهتمام إلى سلالات متقبل مسبقة الصنع، ووصف سلالات مهبط،. أسلوب يسمح للموقع المحدد التكامل من شريط الحمض النووي في مكان الهبوط وسادة هندسيا من سلالة معينة، من خلال تصريف الافعال والتعبير عن integrase ΦC31.

موقع محدد الهندسة الكروموسوم البكتيري: ΦC31 كاسيت الموفقة تبادل Integrase (IMCE)

البكتيريا تنتج مركبات يفرز التي لديها القدرة على التأثير في علم وظائف الأعضاء من جيرانهم الميكروبية. نحن هنا وصف شاشة coculture التي تسمح الكشف عن مثل هذه التفاعلات بين الأنواع بوساطة كيميائيا عن طريق خلط التربة مع سلالات الميكروبات مراسل النسخي الفلورسنت من العصوية الرقيقة على وسائل الاعلام الصلبة.

باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

يقدم هذا العمل طريقة للفحص عالي الإنتاجية باستخدام نظام فحص إنزيم جيني عالمي يمكن تطبيقه نظريا على أكثر من 200 إنزيم. هنا ، يحدد نظام الفحص الفردي ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلوز ، والفوسفاتيز القلوي) ببساطة عن طريق تغيير الركيزة المستخدمة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل).

متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

Spp. السالمونيلا هيدوسنتاريا spp. مسببات الأمراض الشائعة المنسوبة إلى الإسهال. هنا، يمكننا وصف منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. بكر في الوقت الحقيقي باستخدام جنبا إلى جنب مع الثقافة المصحوبة بمرشدين.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

وهنا يقدم بروتوكول لاستخدام الموجودة مسبقاً بنيات الحذف كاسيت مقاومة المضادات الحيوية كأساس لتحقيق طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة هذه الطفرات الحذف وإدراجها في محور المقابلة من سلالة المستلم باستخدام توصيل عاثية P1.

إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية

التضخيم الحراري الأيزوحرارية (LAMP) بوساطة حلقة هو اختبار تضخيم حمض النوى الحرارية (iNAAT) الذي اجتذب اهتمامًا واسعًا في مجال الكشف عن مسببات الأمراض. هنا، نقدم بروتوكول مصباح السالمونيلا متعدد المختبرات كوسيلة سريعة وموثوقة وقوية لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا المفترضة من عزلة الثقافة.

Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة

يصف البروتوكول كيفية تحقيق تعديلات موجهة للموقع في جينوم بعوض ملاريا الأنوفيليس باستخدام نظام φC31 . وتشمل التعديلات الموصوفة كلا من تكامل وتبادل الأشرطة المعدلة وراثيا في جينوم خطوط الالتحام الحاملة ل attP.

التكامل بوساطة φC31 الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا

العطيفة هي السبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء البكتيري المنقول بالغذاء في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أن المؤسسات تسن تدابير للحد من الانتشار في جميع أنحاء منشآتها ، فإن المنتجات الملوثة تصل باستمرار إلى المستهلكين. تعالج التقنية التي تم تطويرها على مدار الاثني عشر عاما الماضية قيود الطرق الحالية لعزل واكتشاف العطيفة spp. من اللحوم النيئة.

الكشف عن وعزل العطيفة spp. من اللحوم النيئة

وصفنا إجراء سهلا لتكملة الكروموسومات أحادية النسخة لجين مضخة التدفق باستخدام نظام تعبير صغير قائم على Tn7 في سلالة مهندسة تعاني من نقص التدفق من Acinetobacter baumannii. تسمح هذه الأداة الجينية الدقيقة بالتعبير الجيني الخاضع للرقابة ، وهو أمر أساسي لتوصيف مضخات التدفق في مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.

توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في الراكدة البوماني باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة

تضع هذه الدراسة مجموعة من إجراءات التشغيل القياسية (SOPs) لفحص وعزل البكتيريا المعوية القادرة على شق C-glycosides.

فحص وعزل بكتيريا C-glycoside-clasinal المعوية

تعلم بروتوكولاً مبسطاً لكشف Integrons من الفئة 1 وكاسيتات الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في الأغذية باستخدام PCR وتسلسل الحمض النووي. يتيح هذا الأسلوب رصد انتشار المقاومة عبر سلسلة الغذاء.

فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات

استكشف المزيد من الفيديوهات