تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

الهدف العام من التجربة التالية هو رسم خريطة لتوزيع بروتينات إصلاح الحمض النووي حول فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل على المقياس النانوي. من أجل دراسة البنية الفائقة للكروماتين التالف الذي يخضع للإصلاح باستخدام التصوير الطيفي الإلكتروني. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء ترميز إنشاءات تعبير الحمض النووي لبروتينات الاندماج لبروتينات الاستجابة لتلف الحمض النووي باستخدام بروتين الفلورسنت وعلامة SOG المصغرة.

كخطوة ثانية ، يتم إدخال التركيبات في الخلايا عن طريق التعدي ، ثم تتلف الخلايا إما بالليزر أو تشعيع جاما. بعد ذلك ، تخضع الخلايا المشعة والثابتة لخطوات تحضير المجهر الإلكتروني من أجل جعل توزيع بروتين الإصلاح المصغر الموسوم ب SOG مرئيا في المجهر الإلكتروني. يوفر التصوير الطيفي الإلكتروني الناتج صورا مفصلة تسمح بتحليل البنية الفائقة للكروماتين وعلاقة بروتينات معينة ببؤر إصلاح الحمض النووي.

الميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا على التقنيات الأخرى الحالية مثل وضع العلامات على ImmunoGold ، هي أنها لا تعتمد على إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة وأنها تصنف هياكل المصالح بكثافة كبيرة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب أن أكسدة الصورة حساسة جدا لشدة ضوء الأس الهيدروجيني وتشبع الأكسجين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات الأكسدة الضوئية وتشبع الأكسجين والإضاءة حساسة للتغييرات الصغيرة جدا ، ولذا من المهم توضيح كيفية تنفيذ الطريقة من أجل إعادة إنتاجها.

سيوضح الدكتور هيلمار فادن ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري ، الطريقة لك الثقافة. خلايا الساركوما العظمية البشرية التي تعبر بثبات عن بروتينات الإصلاح المصغرة SOG و M cherry كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد تقسيم الخلايا من طبق 10 سم ، قم بتنمية الخلايا إلى 80٪ من الطلاقة.

بعد ذلك ، ضع الخلايا تحت مجهر مضان واستخدم قلم ماسي معقم لتحديد مساحة صغيرة تبلغ ملليمترا مربعا واحدا تقريبا تحتوي على خلايا تعبر عن البروتينات خارج الرحم بمجرد وضع علامة عليها ، وقم بتوعية الخلايا عن طريق إضافة هيركس إلى المحلول بحيث يكون التركيز النهائي 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر ، ثم ضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم يقوم الليزر الصغير بإشعاع الخلايا باستخدام ليزر الحالة الصلبة 405 نانومتر من المجهر متحد البؤر من أجل إحداث تلف الحمض النووي بعد تلف الحمض النووي ، وإصلاح الخلايا في الظلام باستخدام مليلتر واحد من 4٪ ألدهيد بارافورم في 0.1 صوديوم مولار. عازلة Cate في درجة حرارة الغرفة بعد 30 دقيقة.

اغسل الخلايا مرتين بأربعة ملليلتر من 0.1 مولار الصوديوم كيت المؤقت عند درجة حموضة 7.4. بعد ذلك ، عالج الخلايا الثابتة بملليلترين من محلول يحتوي على 50 ملليمولر جلايسين ، وخمسة ملليمولار أمينو تريازول ، و 10 ملليمولار سيانيد بوتاسيوم عند درجة حموضة 7.4 لمدة 30 دقيقة. استبدل المخزن المؤقت بملليلترين من المخزن المؤقت للأكسدة الضوئية عند درجة حموضة 7.4 ، والتي تم إعدادها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

ثم احتضان العينة في الظلام على الجليد أثناء فقاعات الأكسجين في المحلول لإبقائها مشبعة بالأكسجين. بعد ذلك ، قم بتركيب الطبق بالخلايا الثابتة بعناية على مجهر مضان مقلوب مزود بعدسة موضوعية غمر بالزيت 40 × وانقله إلى منطقة الاهتمام التي تم تحديدها سابقا. قم بإثارة علامة SOG المصغرة بالضوء الأزرق باستخدام مكعبات الترشيح لبروتين الفلورسنت الأخضر.

استمر في الإضاءة حتى بعد اختفاء مضان SOG المصغر الأخضر تماما. وحتى يظهر منتج أكسدة الصورة البني لضياء أمينو بينادين المبلمر في قناة الضوء المرسلة. ثم بعد تثبيت الخلايا بملليلتر واحد من 2٪ جلوتارالديهايد في 0.1 مولار الصوديوم كيت عازلة عند الرقم الهيدروجيني 7.4 لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإصلاح الأغشية الخلوية ب 0.1 إلى 0.5٪ من رابع أكسيد الأوزميوم في 0.1 مولار من الصوديوم المخزن المؤقت Cate لمدة 20 دقيقة عند درجة الحموضة 7.4. بمجرد إصلاحها ، قم بتجفيف الخلايا من خلال سلسلة من غسول الإيثانول. ثم احتضان الخلايا في خليط واحد لواحد من 100٪ من الإيثانول وراتنج الأكريليك على شاكر لمدة أربع ساعات.

بعد ذلك ، قم بإزالة الخليط وإضافة راتنج الأكريليك بنسبة 100٪ إلى العينات لمدة أربع ساعات إضافية. من أجل بلمرة الراتنج ، قم بقطع غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير المليتر بشفرة حلاقة وقم بتغطية الحافة بمسرع راتنج الأكريليك. املأ الأنبوب بعناية ما يقرب من الثلثين ممتلئا بالراتنج الأبيض LR باستخدام وسادة أنبوب المراعي.

احرص على عدم ملامسة الراتنج للمسرع الموجود على الحافة. قم بإزالة الراتنج الذي تسلل إلى الخلايا في الطبق وضع الطبق رأسا على عقب على أنبوب الطرد المركزي الصغير القائم بشكل مستقيم بحيث يملأ عرض الأنبوب نافذة المراقبة المغطاة بالزجاج بالكامل تقريبا لوزن الطبق. من دقيقة إلى دقيقتين حتى يقوم المسرع بإغلاق الأنبوب وانزلاق الغطاء.

ثم اقلب الأنبوب بحيث يغطي الراتنج الموجود في الأنبوب الخلايا الآن. ضع الطبق مع الأنبوب في فرن على حرارة 60 درجة مئوية وقم بمعالجته لمدة 12 ساعة. عندما يتم معالجة الكتلة ، قم بإزالة الطبق بأنبوب الطرد المركزي الصغير المملوء بالراتنج المرفق من الفرن وافصل أنبوب الطرد المركزي الصغير عن الطبق.

تخلص من الطبق السفلي الزجاجي واقطع بعناية أنبوب الطرد المركزي الصغير بشفرة حلاقة لتحرير الكتلة. باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقص الكتلة بحيث لا يبقى شيء سوى منطقة المليمتر المربع التي تحتوي على المنطقة المميزة مسبقا بقلم الماس أو التنغستن. بعد ذلك ، قم بتركيب الكتلة في ميكروتوم فائق وقم بقص الكتلة بسكين تشذيب حتى يتم الاقتراب من الخلايا.

ثم قم بالتبديل إلى سكين الماس وقم بقص أقسام رفيعة جدا يبلغ طولها حوالي 50 نانومتر عبر الخلايا. التقط الأقسام الموجودة على شبكة 300 شبكة عالية الإرسال. ثم ضع الشبكات في مجبر كربون وقم بتغطية الأقسام بحوالي 0.2 إلى 0.4 نانومتر من الكربون للمساعدة في تثبيتها تحت شعاع الإلكترون في المجهر الإلكتروني الناقل.

قم بتحميل الشبكات في مجهر إلكتروني ناقل الحركة مزود بفلتر طاقة. افحص الخلايا الموجودة على الأقسام باستخدام وضع الإرسال العادي للتكبير المنخفض ومقارنتها بالصور الفلورية التي تم التقاطها سابقا. بمجرد العثور على نواة بها مسار تلف الحمض النووي أو بؤر إصلاح الحمض النووي ، قم بالتبديل إلى وضع تصفية الطاقة وسجل العينة بخريطة سمك.

بعد ذلك ، قم بتسجيل خريطة الفوسفور بعد صور الحافة عند فقدان طاقة الإلكترون 175 بعرض شق يبلغ 20 إلكترون فولت. قم أيضا بتسجيل الصور الممسوترة عند فقدان طاقة 120 إلكترون فولت ، أيضا بعرض شق يبلغ 20 إلكترون فولت لسجل خرائط النيتروجين. صور الحافة المنشورة عند 447 إلكترون فولت بعرض شق 35 إلكترون فولت وصور مسبوطة عند 358 إلكترون فولت.

أيضا بعرض شق 35 إلكترون فولت. افتح خرائط نسبة العناصر في برنامج معالجة الصور مثل هذا. انسخ خريطة النيتروجين إلى القناة الحمراء وخريطة الفوسفور في القناة الخضراء لصورة RGB.

ثم قم بتركيب الخرائط ومحاذاتها. قم بتصدير الصورة المركبة كملف تنسيق ملف صورة مميز، ثم افتح الصورة في برنامج معالجة الصور يمكنه استخدام الطبقات. بعد ذلك ، اضبط النطاق الديناميكي لكل قناة عن طريق إعادة تحجيم الحد الأدنى والأقصى للقيم في الصورة إلى مجموعة بيانات ثمانية بت.

ثم اطرح محتوى الفوسفور من خريطة النيتروجين داخل نافذة الطبقات. قم بتحويل الصورة إلى لون مفهرس وإنشاء جدول بحث أصفر في مساحة ألوان CMYK للخريطة التي تعرض توزيع الحمض النووي وجدول بحث سماوي لإظهار خريطة البروتين غير الكروماتين. ثم قم بإنشاء صورة جديدة واستورد الخرائط التي توضح توزيعات الفوسفور والبروتين غير الكروماتين كطبقات مختلفة.

استخدم وضع شفافية الشاشة لرؤية كلتا الطبقتين متراكبتين على بعضهما البعض. تظهر هنا خرائط نسبة طيفية للإلكترون من داخل نواة الخلية توضح مواقع الفوسفور والنيتروجين عندما يتم تركيب خريطتي النسبة فوق بعضهما البعض في مساحة ألوان RGB. يتم الحصول على صورة مثل تلك الموضحة هنا في هذه الصورة.

تمثل الهياكل الصفراء البروتينات النووية التي تعكس وجود كل من الفوسفور والنيتروجين. هنا ، يتم استخدام التصوير الطيفي الإلكتروني لعرض التغييرات في بنية البؤر بعد تشعيع جاما في خلايا U2 OS. تعبر بثبات عن بروتينات الإصلاح التي تحمل علامة M cherry في الصف العلوي عبارة عن صور للخلايا التي لم يتم تعريضها للإشعاع.

يظهر الصف الثاني الخلايا التي تم إصلاحها بعد ثلاث ساعات من الإشعاع. يظهر الصف الثالث الخلايا الثابتة بعد ست ساعات من الإشعاع. يكشف التصوير الطيفي الإلكتروني أن بنية البؤر تبدو وكأنها تعيد التنظيم بمرور الوقت حيث يبدو أن الكمية النسبية البالغة 53 BP بروتين واحد في التركيز المشار إليه بالزيادة في إشارة النيتروجين تزداد بينما يأخذ الكروماتين المشار إليه بإشارة الفوسفور موقعا محيطيا أكثر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا المشعة التي تعبر عن البروتينات المصغرة لإصلاح البروتينات لتحليل البنية الفائقة للكروماتين في بؤر إصلاح DA باستخدام التصوير الطيفي الإلكتروني. لا تنس أن العمل مع الصوديوم ، والارتباط ، وسيانيد البوتاسيوم ، وأكسيد الأوزميوم ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان وارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.