تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)

الهدف العام من التجربة التالية هو رسم خريطة لتوزيع بروتينات إصلاح DNA حول كسور DNA مزدوجة السلسلة على مقياس النانو. وذلك من أجل دراسة البنية فائقة الدقة للكروماتين التالف الذي يخضع للإصلاح باستخدام التصوير الطيفي الإلكتروني. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء بنيات تعبير DNA تشفر لبروتينات اندماجية من بروتينات الاستجابة لتلف DNA باستخدام بروتين فلوري ووسم mini SOG.

كخطوة ثانية، يتم إدخال البنى الجينية إلى الخلايا عن طريق التعداء (transfection)، ثم يتم إتلاف الخلايا إما باستخدام الليزر أو الأشعة غاما. بعد ذلك، تخضع الخلايا المشععة والمثبتة لخطوات تحضير المجهر الإلكتروني من أجل جعل توزيع بروتين الإصلاح الملحق بـ mini SOG مرئياً في المجهر الإلكتروني. ويوفر التصوير الطيفي الإلكتروني الناتج صوراً تفصيلية تسمح بتحليل البنية الفائقة للكروماتين وعلاقة بروتينات محددة ببؤر إصلاح DNA.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الحالية الأخرى، مثل وسم ImmunoGold، في أنها لا تعتمد على مدى توفر الأجسام المضادة، كما أنها توسم البنى المستهدفة بكثافة عالية. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن عملية الأكسدة الضوئية حساسة للغاية تجاه الـ pH وشدة الضوء وتشبع الأكسجين. لذا، يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، لأن خطوات الأكسدة الضوئية وتشبع الأكسجين والإضاءة تتأثر بتغيرات طفيفة جداً، ومن المهم توضيح كيفية تنفيذ الطريقة لضمان إمكانية تكرارها.

سيقوم الدكتور هلمار فادن، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح طريقة استزراع الخلايا لك. استزرع خلايا الساركوما العظمية البشرية التي تعبر بشكل مستقر عن بروتينات الإصلاح الملحقة بـ mini SOG و M cherry كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. بعد تقسيم الخلايا من طبق بقطر 10 centimeter، اترك الخلايا تنمو حتى تصل درجة التلاقي إلى 80%.

بعد ذلك، ضع الخلايا تحت مجهر فلوري واستخدم قلمًا ماسيًا معقمًا لتحديد منطقة صغيرة تبلغ مساحتها حوالي 1 mm² تحتوي على الخلايا التي تعبر عن البروتينات المنقولة التي تم تعليمها مسبقًا، ثم قم بتحسيس الخلايا عن طريق إضافة herx إلى المحلول بحيث يكون التركيز النهائي 0.5 µg/mL، ثم ضعها في الحاضنة عند 37 °C لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، قم بتسليط أشعة الليزر الدقيقة على الخلايا باستخدام ليزر الحالة الصلبة بطول موجي 405 nm الخاص بمجهر بؤري (confocal microscope) لتحفيز تلف DNA، وعقب تلف DNA، قم بتثبيت الخلايا في الظلام باستخدام 1 mL من 4% paraform aldehyde في 0.1 M sodium Cate buffer في درجة حرارة الغرفة بعد 30 دقيقة.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام 4 mL من محلول منظم صوديوم Cate بتركيز 0.1 molar وعند pH 7.4. بعد ذلك، عالج الخلايا المثبتة بـ 2 mL من محلول يحتوي على 50 millimolar جلايسين، و5 millimolar أمينو تريازول، و10 millimolar سيانيد البوتاسيوم عند pH 7.4 لمدة 30 دقيقة. استبدل المحلول المنظم بـ 2 mL من محلول منظم للأكسدة الضوئية عند pH 7.4، والذي تم تحضيره كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

بعد ذلك، يتم تحضين العينة في الظلام على الثلج مع تمرير فقاعات من الأكسجين في المحلول للحفاظ على تشبعه بالأكسجين. بعد ذلك، يتم وضع الطبق الذي يحتوي على الخلايا المثبتة بعناية على مجهر فلوري مقلوب مجهز بعدسة شيئية غمر زيتي 40x، وتحريكه إلى المنطقة المستهدفة التي تم تحديدها مسبقاً. يتم استثارة وسم mini SOG باستخدام الضوء الأزرق عن طريق استخدام مكعبات ترشيح مخصصة للبروتين الفلوري الأخضر.

استمر في الإضاءة حتى بعد اختفاء الفلورة الخضراء لـ SOG تماماً، وإلى أن يظهر ناتج الأكسدة الضوئية البني لـ dia amino benadine المبلمر في قناة الضوء النافذ. بعد ذلك، قم بتثبيت الخلايا باستخدام 1 mL من glutaraldehyde بتركيز 2% في محلول منظم sodium Cate بتركيز 0.1 molar عند pH 7.4 لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، يتم تثبيت الأغشية الخلوية باستخدام osmium tetroxide بتركيز 0.1 إلى 0.5% في sodium Cate buffer بتركيز 0.1 molar لمدة 20 دقيقة عند pH 7.4. وبمجرد التثبيت، تُجفف الخلايا من خلال سلسلة من غسلات ethanol. ثم تُحضن الخلايا في خليط بنسبة واحد إلى واحد من 100%ethanol وراتنج الأكريليك (acrylic resin) على جهاز هزاز لمدة أربع ساعات.

بعد ذلك، قم بإزالة الخليط وأضف راتنج أكريليك بتركيز 100% إلى العينات لمدة أربع ساعات إضافية. ومن أجل بلمرة الراتنج، قم بقص غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مُصنف باستخدام شفرة حلاقة، ثم غطِّ الحافة بمسرع راتنج الأكريليك. املأ الأنبوب بعناية حتى ثلثيه تقريبًا براتنج LR الأبيض باستخدام ماصة نقل.

احرص على عدم ملامسة الراتنج للمسرع الموجود على الحافة. قم بإزالة الراتنج الذي تسرب إلى الخلايا في الطبق، ثم ضع الطبق مقلوباً فوق أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق القائم بحيث يملأ عرض الأنبوب نافذة المراقبة المغطاة بالزجاج في وزن الطبق بشكل شبه كامل. اترك المسرع لمدة دقيقة إلى دقيقتين لختم الأنبوب وشريحة الغطاء.

بعد ذلك، اقلب الأنبوب بحيث يغطي الراتنج الموجود في الأنبوب الخلايا الآن. ضع الطبق وبداخله الأنبوب في فرن عند درجة حرارة 60 °C واتركه ليتصلب لمدة 12 ساعة. وعندما يتصلب القالب، أخرج الطبق وبداخله أنبوب الطرد المركزي الدقيق المملوء بالراتنج من الفرن، ثم افصل أنبوب الطرد المركزي الدقيق عن الطبق.

تخلص من الطبق ذو القاعدة الزجاجية، واقطع أنبوب الطرد المركزي الدقيق بعناية باستخدام شفرة حلاقة لتحرير الكتلة. وباستخدام شفرة حلاقة، قم بتهذيب الكتلة بحيث لا يتبقى سوى المنطقة التي تبلغ مساحتها مربع مليمتر واحد والتي تحتوي على المنطقة التي تم تعليمها مسبقاً بقلم الماس أو التنجستن. بعد ذلك، قم بتثبيت الكتلة في جهاز الميكروتوم الفائق (ultra microtome) وقم بتهذيب الكتلة باستخدام سكين تهذيب حتى الوصول إلى الخلايا.

بعد ذلك، يتم الانتقال إلى استخدام سكين ماسي لقطع مقاطع فائقة الرقة بسمك 50 nanometers تقريباً عبر الخلايا. تُجمع هذه المقاطع على شبكات 300 mesh ذات نفاذية عالية. ثم توضع الشبكات في جهاز طلاء الكربون، وتُطلى المقاطع بطبقة من الكربون بسمك يتراوح بين 0.2 إلى 0.4 nanometers للمساعدة في تثبيتها تحت شعاع الإلكترونات في المجهر الإلكتروني النافذ.

قم بتحميل الشبكات في مجهر إلكتروني نافذ مجهز بمرشح طاقة. افحص الخلايا في المقاطع باستخدام وضع النفاذ العادي بتكبير منخفض، وقارنها بصور الفلورة التي تم التقاطها مسبقًا. بمجرد العثور على نواة تحتوي على مسار تلف في DNA أو بؤر إصلاح DNA، انتقل إلى وضع ترشيح الطاقة وقم بتسجيل العينة باستخدام خريطة السماكة.

بعد ذلك، قم بتسجيل صور ما بعد الحافة لخريطة الفسفور عند فقدان طاقة إلكترونية قدره 175 electron volts مع عرض شق يبلغ 20 electron volts. قم أيضاً بتسجيل صور ما قبل الحافة عند فقدان طاقة قدره 120 electron volts، وبعرض شق يبلغ 20 electron volts أيضاً من أجل تسجيل خرائط النيتروجين. سجل صور ما بعد الحافة عند 447 electron volts مع عرض شق يبلغ 35 electron volts، وصور ما قبل الحافة عند 358 electron volts.

أيضاً بعرض شق يبلغ 35 electron volts. افتح خرائط النسب العنصرية في برنامج لمعالجة الصور مثل هذا البرنامج. انسخ خريطة النيتروجين في القناة الحمراء وخريطة الفوسفور في القناة الخضراء لصورة RGB.

بعد ذلك، قم بتركيب الخرائط ومحاذاتها. قم بتصدير الصورة المركبة بتنسيق ملف صورة مُوسوم (TIFF)، ثم افتح الصورة في برنامج لمعالجة الصور يدعم استخدام الطبقات. بعد ذلك، اضبط النطاق الديناميكي لكل قناة عن طريق إعادة تحجيم القيم الدنيا والقصوى في الصورة إلى مجموعة بيانات ثمانية بت.

بعد ذلك، اطرح محتوى الفوسفور من خريطة النيتروجين ضمن نافذة الطبقات. حوّل الصورة إلى ألوان مفهرسة وأنشئ جدول بحث أصفر في مساحة ألوان CMYK للخريطة التي توضح توزيع الحمض النووي، وجدول بحث سماوي لإظهار خريطة البروتين غير الكروماتيني. ثم أنشئ صورة جديدة واستورد الخرائط التي توضح توزيعات الفوسفور والبروتين غير الكروماتيني كطبقات مختلفة.

استخدم وضع شفافية الشاشة لرؤية كلتا الطبقتين متراكبتين فوق بعضهما البعض. تظهر هنا خرائط النسبة الطيفية الإلكترونية من داخل نواة خلية، والتي توضح مواقع الفوسفور والنيتروجين عند تراكب خريطتي النسبة فوق بعضهما في مساحة الألوان RGB. يتم الحصول في هذه الصورة على صورة مماثلة لتلك الموضحة هنا.

تمثل الهياكل الصفراء بروتينات نووية تعكس وجود كل من الفسفور والنيتروجين. هنا، يتم استخدام التصوير الطيفي الإلكتروني لعرض التغيرات في بنية البؤر عقب التشعيع بأشعة غاما في خلايا U2 OS. الصور الموجودة في الصف العلوي هي لخلايا لم تتعرض للتشعيع، وهي تعبر بشكل مستقر عن بروتينات الإصلاح الموصومة بـ M cherry.

يُظهر الصف الثاني الخلايا التي تم تثبيتها بعد ثلاث ساعات من التشعيع. ويُظهر الصف الثالث الخلايا التي تم تثبيتها بعد ست ساعات من التشعيع. ويكشف التصوير الطيفي الإلكتروني أن بنية البؤر تبدو وكأنها تعيد تنظيم نفسها بمرور الوقت، حيث تبدو الكمية النسبية لبروتين 53 BP one في البؤرة، والتي يشير إليها ارتفاع إشارة النيتروجين، في تزايد، بينما يتخذ الكروماتين، الذي تشير إليه إشارة الفسفور، موقعاً أكثر طرفية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الخلايا المشععة التي تعبّر عن بروتينات إصلاح الـ mini so لتحليل البنية الفائقة للكروماتين في بؤر إصلاح الـ DA باستخدام التصوير الطيفي الإلكتروني. لا تنسَ أن العمل باستخدام منظم الصوديوم ca correlate ومادة سيانيد البوتاسيوم وأكسيد الأوزميوم يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل داخل خزانة استنشاق الأدخنة وارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.