جيل من تحجيم، لامع عالية الارتفاع Nanocomposites نسبة في البيولوجية السائل المتوسطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مركبات دقيقة ونانوية خطية ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية، وذلك باستخدام مواد بادئة تحتوي على النحاس والسيستين. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق دمج جسيمات النحاس النانوية المعالجة بالموجات فوق الصوتية أو كبريتات النحاس مع السيستين والماء في دورق زراعة معقم ومهوّى. وتتمثل الخطوة الثانية من عملية التخليق في وضع المكونات المدمجة في الدورق داخل حاضنة تحتوي على 5%CO2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات على الأقل.

بعد ذلك، يتم فحص القارورة بالعين المجردة وباستخدام المجهر الضوئي ذو الضوء الأبيض. ولتحديد مدى تشكل البنية الخطية، تتمثل الخطوة النهائية في إنهاء عملية التخليق عن طريق وضع قارورة التخليق في ثلاجة يتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة 4 °C. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الرقمي لتوصيف البنى المُخلّقة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الترسيب القطبى في إمكانية توسيع نطاق التخليق بسهولة في شكل سائل، كما أن العملية تحدث في ظروف فسيولوجية.

تمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص أمراض مثل السرطان لأن البنى الاصطناعية يمكن أن تتحلل بواسطة الخلايا، مما قد يوفر وسيلة لإيصال الأدوية. لقد خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نجري تجارب للبحث في السمية المحتملة لمواد نانوية مختلفة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الاصطناع النهائية قد يكون من الصعب تعلمها.

قد تؤدي الإجراءات غير الصحيحة إلى تكوين تراكيب متكتلة أو عدم تكوين أي تراكيب على الإطلاق. ولإجراء تخليق التجميع الذاتي باستخدام جسيمات النحاس النانوية أو CMPs، قم بتحضير محلول من جسيمات النحاس النانوية عن طريق وزن 2 mg على الأقل من CMPs. ارتدِ قفازات تستخدم لمرة واحدة خلال هذه الخطوة لمنع التلامس المحتمل لـ CMPs مع الجلد.

ضع الجسيمات النانوية في قارورة زجاجية معقمة وفارغة سعة 16 milliliter من القوارورة التي تحتوي على CMPs. أضف ماءً منزوع الأيونات ومعقماً بالحجم المناسب لتحضير محلول بتركيز 2 mg/mL، ثم قم برج المحلول باستخدام جهاز vortex لمدة 20 ثانية لضمان تشتت الجسيمات النانوية قبل بدء عملية الاصطناع. لا تملأ القارورة بالماء لأكثر من النصف لأن ذلك سيؤدي إلى التثبيط.

عند الخلط بواسطة جهاز الدوامة (vortexing)، ستترسب الـ CMPs بسرعة في قاع القارورة وسيظهر لونها داكناً. قم بمعالجة محلول الـ CNP بالموجات فوق الصوتية (sonicate) لمدة 17 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لضمان أقصى تشتت للـ CMPs قبل بدء عملية التخليق. تحقق بشكل دوري للتأكد من اختلاط الـ CMPs بفعل الموجات فوق الصوتية؛ فبعد عملية المعالجة الناجحة، تظل الـ CMPs معلقة في المحلول لمدة 30 دقيقة على الأقل، ويكون لون المحلول داكناً.

قم بوزن 7.29 مليغرام من السيستين لغرض التحضير. ونظراً لأن السيستين لا يذوب مباشرة في الماء، ضع السيستين الموزون في وعاء وزن مضاد للكهرباء الساكنة في وعاء الوزن الذي يحتوي على السيستين. أضف حجماً كافياً من هيدروكسيد الصوديوم العقيم بتركيز واحد مولار حتى يذوب السيستين تماماً لتحضير محلول بتركيز 72.9 مليغرام لكل مليليتر.

أذب السيستين تماماً في 100 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M. ثم امزج 7 µL من السيستين المذاب مع 6,643 µL من الماء المعقم في دورق تخليق معقم. ضع الدورق الذي يحتوي على المحلول الممزوج في الحاضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 °C مع ترك غطاء الدورق مفتوحاً جزئياً لضمان الخلط الفعال.

سيكون هذا هو محلول السيستين العامل. أعد تعليق محلول CNP بتركيز 2 mg/mL عن طريق الرج الدوامي (Vortexing) لمدة 30 ثانية، حيث ستكون CMPs قد ترسبت بعد خطوة المعالجة بالموجات فوق الصوتية (sonication) لحجم تخليق إجمالي يبلغ 7 mL. انقل محلول السيستين العامل إلى دورق زراعة خلايا بمساحة 25 cm² وأضف 350 µL من CMPs المعاد تعليقها.

أغلق سدادة الدورق وأحكم ربطها لضمان إغلاقها بإحكام. بعد دمج جميع مكونات عملية التخليق، اخلط المحتويات بلطف داخل الدورق عن طريق تدويره أربع إلى خمس مرات. ضع الدورق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون، ثم قم بتهوية الدورق عن طريق إرخاء السدادة للسماح بتبادل الغازات دخولاً وخروجاً من الدورق.

أثناء عملية التصنيع، اترك التفاعل يستمر في الحاضنة لمدة 24 ساعة تقريباً. وخلال هذه العملية، يمكن ملاحظة تشكل مركبات خطية للغاية باستخدام المجهر وبالعين المجردة. وتعد هذه الخطوة حاسمة لضمان بدء تشكل بعض البنى ولضمان عدم استمرار عملية التجميع الذاتي لفترة طويلة جداً.

أنهِ عملية تخليق المركبات الحيوية بمجرد ملاحظة التراكيب الخطية في الدورق عن طريق إغلاق دورق التخليق بإحكام، ثم ضع ملصقاً على الدورق يوضح ظروف التخليق، بما في ذلك تاريخ التخليق المستخدم وفترة التحضين، ووقت التخليق قبل الإنهاء. بعد ذلك، احفظ الوعاء في الثلاجة بمجرد أن تظل التراكيب المتكونة مستقرة بهذا الشكل لمدة عام على الأقل. بدلاً من ذلك، ولإجراء تخليق التجميع الذاتي باستخدام كبريتات النحاس، استبدل CMPs بملح كبريتات النحاس باستخدام تقنية معقمة، وأذب 2 mg على الأقل من كبريتات النحاس في حجم كافٍ من الماء منزوع الأيونات المعقم لتحضير محلول بتركيز 2 mg/mL.

تذوب بلورات كبريتات النحاس بسهولة عند هذا التركيز، ولكن يمكن رج الأنبوب باستخدام جهاز الـ vortex إذا لزم الأمر والفحص بالعين للتأكد من ذوبان جميع البلورات بعد تحضير كبريتات النحاس. قم بإجراء عملية التخليق كما تم توضيحه للتو، مع استبدال CMPs بكبريتات النحاس. قم بتوصيف المركبات الحيوية المشتقة من CMPs ومن كبريتات النحاس باستخدام المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني من أجل توصيف المركبات الحيوية وفحصها.

تستخدم عملية التخليق الموازي (Parasynthesis) تحت المجهر الضوئي الأبيض مجهراً مقلوباً. ستترسب المركبات على السطح السفلي للقارورة خلال بضع دقائق من وضع القارورة بشكل مسطح، ومن ثم يمكن ضبط تركيز الرؤية عليها. استخدم إعداد الحقل المضيء (bright field) في المجهر لزيادة التباين بين المركبات الحيوية والوسط السائل؛ حيث ستظهر المركبات المشتقة من CMPs وكبريتات النحاس بلون يتراوح بين الشفاف والمعتم، بينما ستظهر تجمعات CNP غير المتفاعلة بلون داكن جداً.

استخدم مجهر الضوء الأبيض المقلوب لتقييم كفاءة عملية التصنيع لتجربة معينة. على سبيل المثال، وثق وجود أو غياب البوليمرات التناسقية المسامية (CMPs) غير المتفاعلة في عملية التصنيع. دوّن ملاحظات حول الدوارق المستخدمة للمركبات الحيوية المشتقة من الجسيمات النانوية الكربونية (CNP) من الدوارق ذات المعايير المختلفة، مثل وقت الحضانة أو مدة المعالجة بالموجات فوق الصوتية.

تعتبر جسيمات CMP الفردية صغيرة جداً بحيث لا يمكن رؤيتها باستخدام المجهر الضوئي، ولكن تجمعات CNP غير المتفاعلة ستظهر كأجسام داكنة ذات شكل دائري. وهذا على النقيض من مركبات CNP التي تم تخليقها بنجاح، والتي ستتميز بنسبة باعية عالية، وشكل خطي، ونطاق متنوع من الأطوال المختلفة. تجنب إجراء عملية التخليق لفترة طويلة جداً قبل الإنهاء، لأن ذلك سيؤدي إلى تكوين هياكل من نوع قنفذ عالية التفرع يصعب تشتيتها إلى هياكل فردية بمجرد تشكلها.

استخدم أيضاً المجهر الضوئي المقلوب لتقييم فعالية عملية التخليق لتجربة معينة باستخدام كبريتات النحاس. وبما أن كبريتات النحاس تذوب تماماً في المحلول عند اتباع هذا البروتوكول، فإن المحلول سيبدو أقل قتامة من المحلول الناتج عن التخليق باستخدام CMPs.

قم بتوثيق حجم ومدى مركبات كبريتات النحاس من خلال مقارنة الدوارق التي خضعت لظروف تخليق مختلفة، مثل وقت التخليق قبل الإنهاء. لتركيز المركبات الحيوية بعد التخليق أولاً، أضف ستة ملليلترات إما من الهياكل المشتقة من CNP أو الهياكل المشتقة من كبريتات النحاس إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. قم بإجراء الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 500 ×g وفي درجة حرارة الغرفة لتكوين ركازة للأحجام الصغيرة.

أضف 500 µL من الهياكل الموجودة في المحلول إلى أنابيب بحجم 0.6 mL، ثم قم بالطرد المركزي عند 2000 ×g وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل لتكوين راسب. ضع الهياكل في ماء منزوع الأيونات ومعقم، ثم استخدم الموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق على الأقل لإعادة التعليق. باستخدام هذه العملية بمرور الوقت، تصبح الهياكل مجزأة وتقل متوسطات أطوالها.

قم بتوثيق التغيرات في أحجام المركبات مع اختلاف أوقات المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام مجهر الضوء الأبيض المقلوب وكاميرا رقمية؛ حيث تُظهر نتائجنا التمثيلية من دراسة اكتشاف المركبات الحيوية في أوساط الزراعة الخلوية على مدار 82 ساعة أن التشتتات الأولية المتجانسة لـ CMPs تتجمع في هياكل مجهرية. ومع مرور الوقت، يتم التخلص من الجسيمات وتتشكل تجمعات أكبر. وفي النهاية، تظهر تجمعات أكبر ذات هياكل خطية تشكل هياكل تشبه قنفذ البحر.

يوضح الشكل تحويل البوليمرات المجمعة مجهرياً (CMPs) إلى مركبات حيوية خطية. تم دمج CMPs مع السيستين والماء بدءاً من تشتتات متساوية أولية من CMPs. تشكل التجمعات بنيات مجهرية بعد ثلاث ساعات، بينما تتشكل بنيات وسيطة بحلول ست ساعات.

تتشكل هياكل ذات نسبة عرض إلى ارتفاع عالية في المجهر الإلكتروني. يوضح توصيف المركبات الحيوية المصنعة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ أن المادة الأولية لـ CNP كانت خطية، بينما كانت المواد الأولية لـ CMPs مستديرة كما يظهر بواسطة المجهر الإلكتروني الماسح أو SEM. وتوضح صور SEM الميزات النانوية والميكروية للمركبات المتشكلة من CMPs والسيستين.

تم أيضاً تصوير خصائص المركبات المتكونة من كبريتات النحاس والسيستين بواسطة مجهر SEM المزود بتقنية تشتت الطاقة. ويظهر التحليل العنصري بالأشعة السينية (X-ray spectroscopy) للمواد البدائية والمكونات الخطية المُصنّعة. وتُظهر البوليمرات التساهمية المعدنية (CMPs) البدائية قمة نحاس بارزة مع عدم وجود كبريت.

تظهر المركبات الحيوية المكونة من CMPs والسيستين ظهور قمم للكبريت والكربون بسبب السيستين المستخدم في نقطة بداية كبريتات النحاس. وتظهر المادة قممًا للنحاس والكبريت. كما تظهر المركبات الحيوية المكونة من كبريتات النحاس والسيستين ظهور قمم للكربون بسبب السيستين. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون 12 إلى 24 ساعة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة تقدم عملية التصنيع بالعين المجردة وبواسطة المجهر، وذلك لضمان عدم تكتل البنى المصنعة بشكل مفرط. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الوسم الفلوري للبنى من أجل الإجابة على تساؤلات إضافية، مثل مدى ارتباط البنى المصنعة بالخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الكواشف الخاصة بالتصنيع، ودمجها بشكل صحيح، ومراقبة تقدم عملية التصنيع، بالإضافة إلى تركيز وتعديل البنى بعد التصنيع.